Efikasna genetička transformacija Lotus corniculatus L. pomoću direktne regeneracije biljaka, postepene selekcije sa higromicinom B i Agrobacterium tumefaciens super-binarnog vektora
Efficient genetic transformation of Lotus corniculatus L. using a direct shoot regeneration protocol, stepwise hygromycin B selection, and a super-binary Agrobacterium tumefaciens vector
Apstrakt:
Kotiledoni, izolovani sa 6 dana starih klijanaca Lotus corniculatus, sorta Bokor, su se pokazali kao pogodni eksplantati za regeneraciju biljaka bez intermedijarne kalusne faze. Kotiledoni su presecani transverzalno na dve polovine i ko-kultivisani sa Agrobacterium tumefaciens superbinarnim vektorom LBA4404/pTOK233, koji nosi uidA-intron, hpt i nptII gene. Posle ko-kultivacije eksplantati su prvih 14 dana gajeni na regenerativnom medijumu bez selektivnog agensa, a zatim su 21 nedelju bili podvrgnuti selektivnoj proceduri tokom koje je koncentracija antibiotika postepeno povećavana (5-15 mg L-1). Transformisani izdanci dobijeni su 5 meseci nakon ko-kultivacije. Od 124 inicijalno ko-kultivisana eksplantata, dobijene su 52 (42%) biljke koje su preživele selekciju na higromicinu B. Prisustvo uidA transgena u regenerisanim biljkama je potvrđeno pomoću β-glukuronidazne histohemijske reakcije i PCR analizom. T0 biljke, rezistentne na higromicin B i PCR pozitivne, gajene su u stakleniku u cilju produkcije i rastenja cvetova i semena. Dobijenim rezultatima je jasno ukazano da bi saopšteni protokol za transformaciju mogao nesumnjivo biti upotrebljen za introdukciju agronomski značajnih gena u Lotus corniculatus, sorta Bokor.