Transdiferencijacija alfa ćelija pankreasa miša u ćelije koje proizvode insulin ciljanom metilacijom DNK primenom Epi-CRISPR sistema
Transdifferentiation of mouse pancreatic alpha to insulin-producing cells using Epi-CRISPRs directed DNA methylation
Апстракт:
Ekspresija gena za Arx (engl. Aristaless related homeobox) koji ima glavnu ulogu u održavanju identiteta alfa ćelija endokrinog pankreasa regulisana je metilacijom i predstavlja glavni target za ćelijsko reprogramiranje kao jedna od strategija u terapiji dijabetesa koji u osnovi ima poremećen izvor insulina usled propadanja beta ćelija. Cilj ove doktorske disertacije je podrazumevao ispitivanje sposobnosti transdiferencijacije alfa ćelija pankreasa miša u ćelije koje proizvode insulin nakon uvođenja metilacije u promotoru Arx-a. Nakon tranzijentne transfekcije αTC1-6 ćelijske linije pomoću epigenetičkog alata za ciljanu gensku represiju ispitivani su efekti uvedene metilacije na ekspresiju gena specifičnih za beta ćelije. Optimizacijom nukleofekcije αTC1-6 ćelija uspostavljeni su uslovi pomoću kojih je dostignuta efikasnost od 71,1% pri vijabilnosti ćelija od 80%. Visoka efikasnost uvođenja metilacije dCas9-Dnmt3a3L-KRAB fuzionim (EpiCRISPR) konstruktom je pokazana targetovanim bisulfitnim sekvenciranjem. Utišavanje Arx-a praćeno pokretanjem ekspresije Ins2 na 5. i 7. danu nakon transfekcije detektovano je metodom RT-qPCR-a i analizom transkriptoma. Proteinski nivo insulina detektovan je imunocitohemijskom metodom do 12. dana, a oslobađanje iz ćelija enzimskim imunoesejem na 7. danu nakon transfekcije. Pokretanje procesa transdiferencijacije αTC1-6 ćelija ispitivano je analizom prisustva markera beta ćelija. Rezultati su pokazali da jedna tranzijentna transfekcija može da inicira transdiferencijaciju ~1% alfa ćelija pankreasa u ćelije koje proizvode 35% više insulina u odnosu na lažno transfekovane (Mock) alfa ćelije. Delujući na plastičnu prirodu epigenoma, uspešno je iniciran proces direktnog reprogramiranja alfa ćelija pankreasa u ćelije koje proizvode insulin.
Кључне речи:
Arx; CRISPR/Cas9; alfa ćelije pankreasa; dijabetes; editovanje epigenoma; ciljana metilacija DNK; transfekcijaИзвор:
University of Belgrade, Faculty of Biology, 2023, 1-92Финансирање / пројекти:
- Сигнални молекули у дијабетесу: идентификација потенцијалних биолошких маркера укључених у модификацију и интеграцију сигналних путева у циљу предикције и интервенције у дијабетесу (RS-MESTD-Basic Research (BR or ON)-173020)
- Министарство науке, технолошког развоја и иновација Републике Србије, институционално финансирање - 200007 (Универзитет у Београду, Институт за биолошка истраживања 'Синиша Станковић') (RS-MESTD-inst-2020-200007)
- Evropska Fondacije za istraživanja u dijabetesu (EFSD) - grant kompanije AstraZeneca