Efikasna genetička transformacija Lotus corniculatus L. pomoću direktne regeneracije biljaka, postepene selekcije sa higromicinom B i Agrobacterium tumefaciens super-binarnog vektora

Abstract

Cotyledons from 6-day-old Lotus corniculatus cv. Bokor seedlings, transversally cut into two halves, were capa­ble of regenerating buds without intervening callus formation. The explants were co-cultivated with the Agrobacterium tumefaciens LBA4404/pTOK233 superbinary vector carrying the uidA-intron gene and the genes hpt and nptII. They were cultured for 14 days on a regeneration medium, then subjected to a stepwise hygromycin B selection procedure consisting of gradually increasing antibiotic concentrations (5-15 mg L-1) over 21 weeks. Transformed shoots were obtained within 5 months after co-cultivation. Out of 124 initially co-cultivated explants, 52 (42%) plants survived hygromycin B selection. The presence of transgenes in regenerated plants was verified by β-glucuronidase histochemical assays and PCR analysis for the presence of uidA gene sequences. Hygromycin B-resistant and PCR-positive T0 plants were cultured in the greenhouse to produce flowers and seeds. The obtained data demonstrate that the reported transformation protocol could be useful for introducing agriculturally important genes into the new L. corniculatus cultivar Bokor.

Kotiledoni, izolovani sa 6 dana starih klijanaca Lotus corniculatus, sorta Bokor, su se pokazali kao pogodni eksplantati za regeneraciju biljaka bez intermedijarne kalusne faze. Kotiledoni su presecani transverzalno na dve polovine i ko-kultivisani sa Agrobacterium tumefaciens superbinarnim vektorom LBA4404/pTOK233, koji nosi uidA-intron, hpt i nptII gene. Posle ko-kultivacije eksplantati su prvih 14 dana gajeni na regenerativnom medijumu bez selektivnog agensa, a zatim su 21 nedelju bili podvrgnuti selektivnoj proceduri tokom koje je koncentracija antibiotika postepeno povećavana (5-15 mg L-1). Transformisani izdanci dobijeni su 5 meseci nakon ko-kultivacije. Od 124 inicijalno ko-kultivisana eksplantata, dobijene su 52 (42%) biljke koje su preživele selekciju na higromicinu B. Prisustvo uidA transgena u regenerisanim biljkama je potvrđeno pomoću β-glukuronidazne histohemijske reakcije i PCR analizom. T0 biljke, rezistentne na higromicin B i PCR pozitivne, gajene su u stakleniku u cilju produkcije i rastenja cvetova i semena. Dobijenim rezultatima je jasno ukazano da bi saopšteni protokol za transformaciju mogao nesumnjivo biti upotrebljen za introdukciju agronomski značajnih gena u Lotus corniculatus, sorta Bokor.