Izolacija i funkcionalna karakterizacija gena uključenih u sintezu karnozinske kiseline
Isolation and functional characterization of the genes involved in the synthesis of carnosic acid.
2014
Аутори:
Božić, DraganaОстала ауторства
Sabovljević, AnetaKanelis, Angelos
Kanelis, Angelos
Mišić, Danijela
Тип документа:
Докторска теза (Објављена верзија)
Метаподаци
Приказ свих података о документуАпстракт:
Karnozinska kiselina, fenolni diterpen, poseduje brojne biološke
aktivnosti zbog čega je potencijalno veoma značajna za farmaceutsku
industriju. Grčka žalfija (Salvia fruticosa Mill.) i ruzmarin (Rosmarinus
officinalis L.) bogati su prirodni izvori ovog jedinjenja. Iako je mnogo toga
poznato u vezi strukture i bioloških aktivnosti karnozinske kiseline,
veoma malo se ne zna o njenom biosintetskom putu u biljkama. Osnovni cilj
disertacije bio je izučavanje biosinteze karnozinske kiseline na
molekularnom nivou, izolacijom i funkcionalnom karakterizacijom gena
uključenih u ovaj proces. U tu svrhu, izvršena je analiza postojeće cDNK
biblioteke žlezdanih dlaka grčke žalfije, što je za rezultat imalo
identifikaciju dva gena, nazvanih SfCPS i SfKSL, koji potencijalno
kodiraju diterpen sintaze. Geni kandidati su izolovani i funkcionalno
okarakterisani u bakteriji Escherichia coli Mig., kvascima (Saccharomyces
cerevisiae Meyen ex E. C. Hansen) i duvanu (Nicotiana benthamiana Domin).
Heterologa ekpresija gena SfCPS i SfKSL rezultirala je sintezom
miltiradiena, što je utvrđeno GC-MS analizom i 1D i 2D NMR
spektroskopijom (1H, 13C, DEPT, COSY H-H, HMQC i HMBC). Za pronalaženje
preostalih gena odgovornih za biosintezu karnozinske kiseline, obavljeno
je sekvencioniranje transkriptoma grčke žalfije i ruzmarina, uz
korišćenje 454 GS FLX Titanium platforme. Na osnovu rezultata
fitohemijske analize LC-PDA-LTQ-Orbitrap FTMS metodom, žlezdane dlake
mladih listova blago stresiranih biljaka genotipa “Kavusi” grčke žalfije
i žlezdane dlake mlađih stadijuma razvoja komercijalnog genotipa
ruzmarina (B & T World Seeds) izabrane su kao biljni materijal za analizu
transkriptoma. Rezultat sekvencioniranja bio je anotacija velikog broja
novih sekvenci, a posebno značajna bila je identifikacija gena
metaboličkih puteva povezanih sa sekundarnim metabolizmom. Izolovano je
ukupno 24 gena koji su kodirali za enzime familije citohrom P450 (CYP)
monooksigenaze. Funkcija enzima CYP76Sf2 grčke žalfije, i CYP76Ro3 i
CYP76Ro4 ruzmarina, kao feruginol sintaza, utvrđena je esejima
funkcionalne karakterizacije u kvascima i duvanu. Kloniranje i
funkcionalna karakterizacija gena koji svojom zajedničkom aktivnošću
dovode do sinteze feruginola kod grčke žalfije i ruzmarina, pruža osnovu
budućim istraživanjima biosintetskog puta karnozinske kiseline. Uz to,
izvršena je lokalizacija biosintetskog puta karnozinske kiseline u
žlezdanim dlakama grčke žalfije i ruzmarina. Priloženi rezultati
doprinose boljem razumevanju metabolizma karnozinske kiseline, i time
omogućavaju primenu najsavremenijih biotehnoloških metoda za proizvodnju
ovog farmaceutski značajnog jedinjenja.
Кључне речи:
Salvia fruticosa; Rosmarinus officinalis; Karnozinska kiselina; Miltiradien; Feruginol; Fenolni diterpeni; Karakterizacija gena; Diterpen sintaze; Citohrom p450 monooksigenazeИзвор:
University of Belgrade, Faculty of Biology, 2014, 1-216Финансирање / пројекти:
- Plant Terpenoids for Human Health: a chemical and genomic approach to identify and produce bioactive compounds (EU-FP7-227448)
URI
http://eteze.bg.ac.rs/application/showtheses?thesesId=2848https://fedorabg.bg.ac.rs/fedora/get/o:11054/bdef:Content/download
http://vbs.rs/scripts/cobiss?command=DISPLAY&base=70036&RID=1025012658
http://nardus.mpn.gov.rs/123456789/5284
https://radar.ibiss.bg.ac.rs/handle/123456789/2378