Izolacija i funkcionalna karakterizacija gena uključenih u sintezu karnozinske kiseline

Abstract

Karnozinska kiselina, fenolni diterpen, poseduje brojne biološke aktivnosti zbog čega je potencijalno veoma značajna za farmaceutsku industriju. Grčka žalfija (Salvia fruticosa Mill.) i ruzmarin (Rosmarinus officinalis L.) bogati su prirodni izvori ovog jedinjenja. Iako je mnogo toga poznato u vezi strukture i bioloških aktivnosti karnozinske kiseline, veoma malo se ne zna o njenom biosintetskom putu u biljkama. Osnovni cilj disertacije bio je izučavanje biosinteze karnozinske kiseline na molekularnom nivou, izolacijom i funkcionalnom karakterizacijom gena uključenih u ovaj proces. U tu svrhu, izvršena je analiza postojeće cDNK biblioteke žlezdanih dlaka grčke žalfije, što je za rezultat imalo identifikaciju dva gena, nazvanih SfCPS i SfKSL, koji potencijalno kodiraju diterpen sintaze. Geni kandidati su izolovani i funkcionalno okarakterisani u bakteriji Escherichia coli Mig., kvascima (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E. C. Hansen) i duvanu (Nicotiana benthamiana Domin). Heterologa ekpresija gena SfCPS i SfKSL rezultirala je sintezom miltiradiena, što je utvrđeno GC-MS analizom i 1D i 2D NMR spektroskopijom (1H, 13C, DEPT, COSY H-H, HMQC i HMBC). Za pronalaženje preostalih gena odgovornih za biosintezu karnozinske kiseline, obavljeno je sekvencioniranje transkriptoma grčke žalfije i ruzmarina, uz korišćenje 454 GS FLX Titanium platforme. Na osnovu rezultata fitohemijske analize LC-PDA-LTQ-Orbitrap FTMS metodom, žlezdane dlake mladih listova blago stresiranih biljaka genotipa “Kavusi” grčke žalfije i žlezdane dlake mlađih stadijuma razvoja komercijalnog genotipa ruzmarina (B & T World Seeds) izabrane su kao biljni materijal za analizu transkriptoma. Rezultat sekvencioniranja bio je anotacija velikog broja novih sekvenci, a posebno značajna bila je identifikacija gena metaboličkih puteva povezanih sa sekundarnim metabolizmom. Izolovano je ukupno 24 gena koji su kodirali za enzime familije citohrom P450 (CYP) monooksigenaze. Funkcija enzima CYP76Sf2 grčke žalfije, i CYP76Ro3 i CYP76Ro4 ruzmarina, kao feruginol sintaza, utvrđena je esejima funkcionalne karakterizacije u kvascima i duvanu. Kloniranje i funkcionalna karakterizacija gena koji svojom zajedničkom aktivnošću dovode do sinteze feruginola kod grčke žalfije i ruzmarina, pruža osnovu budućim istraživanjima biosintetskog puta karnozinske kiseline. Uz to, izvršena je lokalizacija biosintetskog puta karnozinske kiseline u žlezdanim dlakama grčke žalfije i ruzmarina. Priloženi rezultati doprinose boljem razumevanju metabolizma karnozinske kiseline, i time omogućavaju primenu najsavremenijih biotehnoloških metoda za proizvodnju ovog farmaceutski značajnog jedinjenja.

Carnosic acid is a phenolic diterpene potentially highly significant for the pharmaceutical industry, due to its numerous biological activities. Cretan sage (Salvia fruticosa Mill.) and Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) are rich natural sources of this compound. Although the structure and biological activities of carnosic acid are widely known, its biosynthetic pathway in plants remains unexplored. The main aim of the dissertation was to investigate the carnosic acid biosynthesis at the molecular level, by isolating and functionally characterizing the genes involved in this process. For that purpose, the existing Cretan sage trichome cDNA library has been analyzed, which has resulted in the identification of two putative diterpene synthase genes, named SfCPS and SfKSL. The candidate genes were isolated and functionally characterized in Escherichia coli Mig., yeast (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E. C. Hansen) and Nicotiana benthamiana Domin. Heterologous expression of SfCPS and SfKSL genes has resulted in the synthesis of miltiradiene, which has been confirmed by GC-MS analysis and 1D and 2D NMR spectroscopy (1H, 13C, DEPT, COSY H-H, HMQC и HMBC). In order to retrieve the remaining genes responsible for the biosynthesis of carnosic acid, the glandular trichomes of Cretan sage and Rosemary have been sequenced using 454 GS FLX Titanium platform. Based on the results of the LC-PDA-LTQ-Orbitrap FTMS phytochemical analysis, glandular trichomes of Cretan sage young leaves (genotype Kavoussi) exposed to mild stress, and glandular trichomes on the Rosemary leaves of the younger developmental stage (commercial genotype B&T World Seeds), were chosen for the transcriptome analysis...