Antioksidativno, antimikrobno i alelopatsko dejstvo tri endemične vrste roda Nepeta (Lamiaceae)

Abstract

Nepeta rtanjensis Diklić i Milojević, N. sibirica L. i N. nervosa Royle ex Bentham (fam. Lamiaceae) su endemične vrste roda Nepeta, koje su nedovoljno fitohemijski okarakterisane i slabo ispitane u pogledu biološke aktivnosti. Radi se o vrstama koje se odlikuju različitim kvalitativnim i kvantitativnim sadržajem nepetalaktona, zbog čega predstavljaju idealne objekte u istraživanjima biološke aktivnosti različitih izomera ovog monoterpenskog jedinjenja. S obzirom da se radi o retkim vrstama, a u slučaju N. rtanjensis i o krajnje ugroženoj vrsti, biljni materijal za potrebe eksperimenata je dobijen mikropropagacijom. Istraživanje je obuhvatilo fitohemijske analize sekundarnih metabolita tri vrste roda Nepeta gajenih in vitro, kao i analizu njihovih bioaktivnih svojstava kao što su antimikrobno, antioksidativno i alelopatsko dejstvo. Fitohemijska karakterizacija tri vrste roda Nepeta gajenih in vitro, omogućila je identifikaciju i kvantifikaciju glavnih grupa sekundarnih metabolita (terpenoida i fenolnih jedinjenja) koji se u ovim uslovima produkuju. Metode koje su korišćene u fitohemijskim analizama su: GC-MS, GC-FID, PTR-MS, Headspace GC-MS, HPLCUV, HPLC-MS, UHPLC/DAD/±HESI-MS/MS. Dominantno isparljivo jedinjenje iz grupe terpenoida je monoterpenski lakton - nepetalakton, pri čemu je kod vrste N. rtanjensis većinski prisutan tran,cis- izomer a kod N. sibirica cis,trans- izomer nepetalaktona. Kod vrste N. nervosa nepetalakton je detektovan samo u tragovima. Kod ispitivanih vrsta, ruzmarinska kiselina se javlja kao dominantno fenolno jedinjenje, dok su ostale fenolne kiseline (hlorogena, neohlorogena i kafeinska kiselina) prisutne u znatno nižoj koncentraciji. Metanolni ekstrakti N. rtanjensis, N. sibirica i naročito N. nervosa, pokazuju značajnu antioksidativnu aktivnost u ABTS i DPPH testovima, kao i visoki kapacitet za redukciju gvožđa u FRAP testu. Značajna antioksidativna aktivnost se pripisuje fenolnim jedinjenjima, na prvom mestu ruzmarinskoj kiselini. Nepetalakton ne utiče značajno na antioksidativni potencijal metanolnih ekstrakata, ali postoji mogućnost antagonističkog delovanja između fenolnih kiselina i nepetalaktona. Metanolni ekstrakti tri vrste roda Nepeta pokazuju značajnu antimikrobnu aktivnost protiv osam vrsta bakterija i osam vrsta gljiva, a aktivnost potiče od monoterpenskih laktona i fenolnih jedinjenja. Najveću antimikrobnu aktivnost pokazuje metanolni ekstrakt N. rtanjensis, sledi N. sibirica, i na kraju N. nervosa. Stereohemija nepetalaktona bitno određuje njegovu antimirobnu aktivnost, pri čemu je trans,cisizomer aktivniji od cis,trans-izomera. Potvrđeno je da vrste N. rtanjensis i N. sibirica poseduju jedinjenja koja mogu uticati na rastenje i razviće drugih biljnih vrsta u njihovom neposrednom okruženju, i na taj način aktivno učestvovati u alelopatskim interakcijama. Alelopatsko dejstvo N. rtanjensis i N. sibirica potiče od dominantnog bioaktivnog jedinjenja ovih vrstanepetalaktona. Stereohemija nepetalaktona značajno određuje njegov alelopatski potencijal, pri čemu tran,cis- izomer pokazuje veću aktivnost od cis,trans- izomera. Alelopatsko dejstvo nepetalaktona se ogleda kroz usporenu dinamiku klijanja semena test vrste Lepidium sativum L., ali i kroz efekat na biohemijske procese koji su posledica poremećenog antioksidativnog sistema biljaka. Alelopatsko dejstvo nepetalaktona, a naročito njegovog trans,cis- izomera, dovodi do promena u antioksidativnom sistemu klijanaca kresa narušavanjem normalnih modela ekspresije i aktivnosti antioksidativnih enzima (POD, CAT, SOD, PPO). Primećena je inhibicija aktivnosti, kao i izmenjen profil izoformi POD, CAT, Fe-SOD i CuZn-SOD kod klijanaca kresa. Trans,cisnepetalakton dovodi do povećanog sadržaja ukupnih fenola u prvim fazama rastenja i razvića klijanaca L. sativum, što je praćeno ranijom indukcijom ekspresije i povećanom aktivnošću PPO. Nepetalakton tokom alelopatskih interakcija indukuje određene modifikacije metabolizma sinapata kod klijanaca kresa, koje se generalno mogu opisati usporenim prevođenjem sinapoil- holina do sinapoil- glukoze, i potom do sinapoilmalata. Alelopatska svojstva N. rtanjensis i N. sibirica ukazuju na mogućnost uspešne primene ovih vrsta i njihovih bioaktivnih komponenti u poljoprivrednoj praksi, kao bioherbicida, a u cilju suzbijanja i kontrole korovskih vrsta. U ovom radu potvrđeno je alelopatsko dejstvo N. rtanjensis i N. sibirica u slučaju poljoprivrednih kultura kao što su L. sativum, Lactuca sativa L. sorta „Majska kraljica“, Lotus corniculatus L. sorta „Bokor“, Brassica napus L., i korovskih vrsta poput Stellaria media (L.) Vill., Rumex crispus L., i Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ekotip Kolumbija.

Nepeta rtanjnsis Diklić and Milojević, N. sibirica L. and N. nervosa Royle ex Bentham (fam. Lamiaceae) are endemic species of genus Nepeta that are insufficiently phytochemically characterized and poorly tested in a sense of their biological activity. These three species are characterized by different qualitative and quantitative nepetalactone content, what makes them ideal objects in investigating the biological activity of different stereoisomers of this compound. Considering that these species are rare, and extremely endangered in case of N. rtanjensis, plant material for the experiments was obtained by micropropagation. The research included phytochemical characterization of in vitro grown three Nepeta species , as well as analysis of their bioactivities such as antimicrobial, antioxidative activity and allelopathic potential. Phytochemical characterization of three Nepeta species grown in vitro, involving GC-MS, GC-FID, PTR-MS, Headspace GC-MS, HPLC-UV, HPLC-MS, and UHPLC/DAD/±HESI-MS/MS analyses, enabled identification and quantification of the main secondary metabolites (terpenes and phenolics). The dominant volatile compound from terpenes group is monoterpene lacton - nepetalactone, whereby its trans,cisisomer is mostly present in N. rtanjensis and its cis,trans- isomer in N. sibirica. In N. nervosa, nepetalactone has been detected only in traces. In all investigated species, rosmarinic acid is a dominant phenolic compound, while the other phenolic acids (chlorogenic, neochlorogenic and caffeic acids) are present in significantly lower concentrations. The results of ABTS and DPPH assays showed that methanol extracts of N. rtanjensis, N. sibirica and especially N. nervosa, possess considerable antioxidant activities, and the FRAP assay revealed high ferric reducing capacity for all the samples tested.. Significant antioxidant activity is attributed to phenolic acids, in the first place to rosmarinic acid. Nepetalactone doesn’t contribute notably to the antioxidant potential of the methanol extracts, but there is a possibility of antagonistic action between phenolic acids and nepetalactone. The methanol extracts of three Nepeta species show significant antimicrobial activity against eight bacterial and eight fungal species, and the activity originates from monoterpenic lactones and phenolic acids. The highest antimicrobial activity was recorded for N. rtanjensis methanol extract, while extracts of N. sibirica and N. nervosa were less efficient. Nepetalactone stereochemistry substantially determines its antimicrobial activity, whereby the trans,cis- isomer is more active than the cis,trans- one. It has been confirmed that N. rtanjensis and N. sibirica possess compounds that can influence growth and development of other plant species in their proximate surrounding, thus actively participating in allelopathic interactions. Allelopathic effect of N. rtanjensis and N. sibirica originates from the dominant bioactive compound of these species - nepetalactone. Stereochemistry of nepetalactone considerably determines its allelopathic potential, with trans,cis- isomer being more active than the cis,transnepetalactone. Allelopathic effect of nepetalactone is reflected through slugged dynamic of seed germination in the test species Lepidium sativum L., but also through its effect on biochemical processes that are the consequence of plant’s disturbed antioxidative system. Allelopathic effect of nepetalactone, especially of its trans,cis- isomer, leads to the changes in antioxidative system of cress seedlings by violating normal models of antioxidative enzymes expression and activity (POD, CAT, SOD, PPO). In cress seedlings, the inhibition of activities and changed profiles of POD, CAT, Fe-SOD and CuZn-SOD isoforms were observed. Trans,cis- nepetalactone action leads to the increased content of total phenols in the first phases of growth and development of L. sativum seedlings, which is followed by earlier induction of expression and increased PPO activity. During allelopathic interactions, nepetalactone induces certain modifications of sinapate metabolism in cress seedlings, which in general can be described by decreased conversion of sinapoylholin to sinapoylglucose, and further to sinapoylmalate. Allelopathic features of N. rtanjensis and N. sibirica indicate the possibility of successful application of these species and their bioactive components in agricultural practice, as bioherbicides, toward weed control. In this thesis the allelopathic effect of N. rtanjensis and N. sibirica was confirmed in case of crops L. sativum, Lactuca sativa L. cv. „Majska kraljica“, Lotus corniculatus L. cv. „Bokor“, and Brassica napus L., and weeds Stellaria media (L.) Vill., Rumex crispus L., and Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotype Colombia.