Uticaj propofola na signalni put neurotrofina u prednjem mozgu pacova starih 14 dana

Abstract

Neurotrofini čine familiju signalnih molekula sa brojnim uticajima na rast, preživljavanje, diferencijaciju i sinaptičku plastičnost postmitotskih neurona, kako u adultnom mozgu, tako i u mozgu tokom razvića. Neurotrofini (BDNF, NGF) se sa određenim afinitetom vezuju za Trk receptore, iniciraju njihovu dimerizaciju i autofosforilaciju i na taj način se pokreće aktivacija signalnih puteva kao što su PI3K/Akt i MAPK/ERK. Akt i ERK kinaze imaju ključne regulatorne uloge u mozgu u procesima kao što su neuronalna proliferacija, diferencijacija, razviće, migracija, preživljavanje i dugotrajna sinaptička plastičnost. Aktivan (fosforilisan) Akt štiti ćeliju od apoptoze tako što stimuliše ekspresiju proteina koji favorizuju preživljavanje ćelija i sa druge strane inhibira egzekutorske kaspaze. Aktivacija ERK1/2 kinaze pomoviše preživljavanje, međutim u određenim uslovima ERK1/2 može imati i pro-apoptotske odlike. S obzirom da je uloga neurotrofina u neurotoksičnosti koja je indukovana anestezijom tokom ranog postnatalnog razvića pokazana u nekoliko studija, cilj ove doktorske disertacije je bio da se na molekulskom nivou ispitaju promene u signalnom putu neurotrofina koje nastaju u kori i talamusu postnatalnih pacova nakon primene anestetske doze propofola, kao i da se utvrdi potencijal tretmana da indukuje ćelijsku smrt i/ili promene u sinaptičkoj plastičnosti. Nakon jednokratne primene propofola (25 mg/kg i.p.) ispitana je vremenska i prostorna ekspresija neurotrofina BDNF i NGF, njihovih aktiviranih receptora TrkB, TrkA i p75 receptora, kao i nishodnih kinaza Akt i ERK kod 14 dana starih (PND14) pacova. Ispitan je i potencijal propofolskog tretman da indukuje ćelijsku smrt, praćenjem ekspresije TNF-α, TNFR1, aktivnog fragmenta kaspaze-3, njegovog inhibitora XIAP proteina, kao i transkripcionog faktora NFκB. Finalno je ispitivan potencijal propofolskog tretmana da indukuje promene u ekspresiji markera sinaptičke plastičnosti (MAP-2, drebrina, GAP-43, sinaptofizina, sinukleina-1 i N-kadherina). Promene su praćene u kori i talamusu kao primarnim ciljevima dejstva anestetskog delovanja. Primenom sledećih metoda Western blot analize, RT- i PCR-a u realnom vremenu ispitivane su promene u ekspresiji ciljnih proteina i iRNK, a primenom Fluoro-žad B histološkog bojenja analizirana je pojava neurona u degeneraciji. Dobijeni rezultati su pokazali da je propofolski tretman doveo do značajnih promena u nivoima ispitivanih neurotrofina, njihovih receptora i nishodnih efektorskih kinaza. Ove promene nisu povezane sa povećanom neurodegeneracijom ni u kori, ni u talamusu, ali su detektovane značajne promene u zastupljenosti ispitivanih markera sinaptičke plastičnosti. Naši podaci pokazuju da je ekspresija neurotrofina BDNF i NGF različito regulisana u odgovoru na propofolski tretman i da se najznačajnije promene u PND14 mozgu odigravaju preko BDNF signalnog puta i u znatno manjoj meri preko NGF signalnog puta. Smatramo da prekomerna ekspresjia BDNF-a u našem eksperimentalnom modelu nije isključivo ograničena na neuronalno preživljavanje, već i na određene aspekte sinaptičke plastičnosti. Pored promene u ekspresiji neurotrofina, propofolski tretman je indukovao promene u ekspresiji Akt i ERK kinaza na regionalno-specifičan način. Fluoro-žad B histohemijsko bojenje nije pokazalo neuronalnu degeneraciju, uprkos prolaznom povećanju u ekspresiji aktivnog fragmenta kaspaze-3. Detektovane su značajne regionalno-specifične promene u ekspresiji markera sinaptičke plastičnosti nakon propofolskog tretmana. Možemo zaključiti da opšti anestetik propofol ispoljava kompleksne efekte na neurotrofine i njihove nishodne signalne puteve u mozgu pacova tokom ranog postnatalnog razvića. Dobijeni rezultati ukazuju da u mozgu PND14 životinja aktivacija Akt i ERK signalnih puteva predstavlja važan aspekt endogenih odbrambenih mehanizama kojim se mladi mozak štiti od potencijalnih neželjenih efekata izazvanih jednokratnom primenom propofola. Balansirana ekspresija ove dve kinaze u istom regionu mozga je važna za odgovarajući izlazni signal i povoljan fiziološki ishod. Preciznije razjašnjenje molekulskih mehanizama koji se pokreću nakon izlaganja mladih eksperimentalnih životinja opštoj anesteziji može pomoći u boljem razumevanju starosno-zavisne komponente neurotoksičnosti i neuroplastičnosti koje izaziva primena opštih anestetika u kliničkoj pedijatriji.

Neurotrofini čine familiju signalnih molekula sa brojnim uticajima na rast, preživljavanje, diferencijaciju i sinaptičku plastičnost postmitotskih neurona, kako u adultnom mozgu, tako i u mozgu tokom razvića. Neurotrofini (BDNF, NGF) se sa određenim afinitetom vezuju za Trk receptore, iniciraju njihovu dimerizaciju i autofosforilaciju i na taj način se pokreće aktivacija signalnih puteva kao što su PI3K/Akt i MAPK/ERK. Akt i ERK kinaze imaju ključne regulatorne uloge u mozgu u procesima kao što su neuronalna proliferacija, diferencijacija, razviće, migracija, preživljavanje i dugotrajna sinaptička plastičnost. Aktivan (fosforilisan) Akt štiti ćeliju od apoptoze tako što stimuliše ekspresiju proteina koji favorizuju preživljavanje ćelija i sa druge strane inhibira egzekutorske kaspaze. Aktivacija ERK1/2 kinaze pomoviše preživljavanje, međutim u određenim uslovima ERK1/2 može imati i pro-apoptotske odlike. S obzirom da je uloga neurotrofina u neurotoksičnosti koja je indukovana anestezijom tokom ranog postnatalnog razvića pokazana u nekoliko studija, cilj ove doktorske disertacije je bio da se na molekulskom nivou ispitaju promene u signalnom putu neurotrofina koje nastaju u kori i talamusu postnatalnih pacova nakon primene anestetske doze propofola, kao i da se utvrdi potencijal tretmana da indukuje ćelijsku smrt i/ili promene u sinaptičkoj plastičnosti. Nakon jednokratne primene propofola (25 mg/kg i.p.) ispitana je vremenska i prostorna ekspresija neurotrofina BDNF i NGF, njihovih aktiviranih receptora TrkB, TrkA i p75 receptora, kao i nishodnih kinaza Akt i ERK kod 14 dana starih (PND14) pacova. Ispitan je i potencijal propofolskog tretman da indukuje ćelijsku smrt, praćenjem ekspresije TNF-α, TNFR1, aktivnog fragmenta kaspaze-3, njegovog inhibitora XIAP proteina, kao i transkripcionog faktora NFκB. Finalno je ispitivan potencijal propofolskog tretmana da indukuje promene u ekspresiji markera sinaptičke plastičnosti (MAP-2, drebrina, GAP-43, sinaptofizina, sinukleina-1 i N-kadherina). Promene su praćene u kori i talamusu kao primarnim ciljevima dejstva anestetskog delovanja. Primenom sledećih metoda Western blot analize, RT- i PCR-a u realnom vremenu ispitivane su promene u ekspresiji ciljnih proteina i iRNK, a primenom Fluoro-žad B histološkog bojenja analizirana je pojava neurona u degeneraciji. Dobijeni rezultati su pokazali da je propofolski tretman doveo do značajnih promena u nivoima ispitivanih neurotrofina, njihovih receptora i nishodnih efektorskih kinaza. Ove promene nisu povezane sa povećanom neurodegeneracijom ni u kori, ni u talamusu, ali su detektovane značajne promene u zastupljenosti ispitivanih markera sinaptičke plastičnosti. Naši podaci pokazuju da je ekspresija neurotrofina BDNF i NGF različito regulisana u odgovoru na propofolski tretman i da se najznačajnije promene u PND14 mozgu odigravaju preko BDNF signalnog puta i u znatno manjoj meri preko NGF signalnog puta. Smatramo da prekomerna ekspresjia BDNF-a u našem eksperimentalnom modelu nije isključivo ograničena na neuronalno preživljavanje, već i na određene aspekte sinaptičke plastičnosti. Pored promene u ekspresiji neurotrofina, propofolski tretman je indukovao promene u ekspresiji Akt i ERK kinaza na regionalno-specifičan način. Fluoro-žad B histohemijsko bojenje nije pokazalo neuronalnu degeneraciju, uprkos prolaznom povećanju u ekspresiji aktivnog fragmenta kaspaze-3. Detektovane su značajne regionalno-specifične promene u ekspresiji markera sinaptičke plastičnosti nakon propofolskog tretmana. Možemo zaključiti da opšti anestetik propofol ispoljava kompleksne efekte na neurotrofine i njihove nishodne signalne puteve u mozgu pacova tokom ranog postnatalnog razvića. Dobijeni rezultati ukazuju da u mozgu PND14 životinja aktivacija Akt i ERK signalnih puteva predstavlja važan aspekt endogenih odbrambenih mehanizama kojim se mladi mozak štiti od potencijalnih neželjenih efekata izazvanih jednokratnom primenom propofola. Balansirana ekspresija ove dve kinaze u istom regionu mozga je važna za odgovarajući izlazni signal i povoljan fiziološki ishod. Preciznije razjašnjenje molekulskih mehanizama koji se pokreću nakon izlaganja mladih eksperimentalnih životinja opštoj anesteziji može pomoći u boljem razumevanju starosno-zavisne komponente neurotoksičnosti i neuroplastičnosti koje izaziva primena opštih anestetika u kliničkoj pedijatriji.