Fitohemijska i molekularno-genetička karakterizacija populacija kičice (Centaurium erythraea Rafn) sa Balkanskog poluostrva

Abstract

Kičica (Centaurium erythraea Rafn) je farmakološki atraktivna biljna vrsta koja pokazuje čitav spektar bioloških aktivnosti, a čiji je biodiverzitet nedovoljno istražen. Osnovni cilj predstavljenog istraživanja jeste analiza genetičkog i fitohemijskog diverziteta kičice na teritoriji Balkanskog poluostrva. U tom smislu, formirana je kolekcija semena kičice poreklom iz prirodnih populacija, koja oslikava diverzitet vrste na ovom području. Istraživanja su uključila 43 populacije ove vrste, od kojih je 41 poreklom sa Balkanskog poluostrva. Za procenu genetičkog diverziteta optimizovane su tehnike RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) i TRAP (Target Region Amplification Polymorphism) molekularnih marker sistema. DNK upotrebljena u ovim analizama je izolovana iz biljaka gajenih u uslovima in vitro, kako bi se obezbedila autentičnost DNK kičice i eliminisala mogućnost kontaminanacije stranom DNK. Za potrebe dobijanja što većeg broja informativnih jedinica, upotrebljeno je 16 desetomernih prajmera u slučaju RAPD markera, pri čemu je dobijeno ukupno 408 različitih PCR produkata, dok su za TRAP markere upotrebljene kombinacije tri specifična i tri arbitrarna prajmera i dobijeno je 767 fragmenata DNK. Specifični prajmeri korišćeni u TRAP analizama, konstruisani su na osnovu sekvenci RNK kičice sa visokim stepenom homologije sa DNK sekvencama za sledeće enzime: geraniol 10-hidroksilaza, citohrom P450 reduktaza i sekologanin sintaza, objavljenih u elektronskim bazama podataka. Primenom molekularnih markera dobijen je visok procenat polimorfizma, a informativnost odabranih prajmera ili kombinacija prajmera je potvrđena pomoću više parametara. Ustanovljena je vrlo niska unutarpopulaciona genetička varijabilnost kičice, što može da se objasni velikim udelom samooplodnje i geitonogamije u nastanku Rezime/Summary semena kod prirodnih populacija, kao i snažnim genetičkim driftom. S obzirom da se kičica javlja u malim i fragmentisanim populacijama, između kojih verovatno ne postoji protok gena, očekivana je i visoka genetička diferenciranost analiziranih populacija, što je potvrđeno i metodama molekularnih markera. Osim toga, molekularnim markerima vrlo uspešno su razdvojene diploidne od tetraploidnih populacija kičice. Tetraploidne populacije se prilično jasno diferenciraju u posebne grupe koje su povezane sa njihovim geografskim poreklom, naročito kada su primenjeni RAPD markeri. Značajna korelacija pokazana je između genetičkih sličnosti populacija kičice sa Balkanskog poluostrva, dobijenih pomoću dva tipa molekularnih markera i geografskih distanci lokaliteta sa kojih ove populacije potiču. Određivanje i kvantifikacija osnovnih jedinjenja sekundarnog metabolizma kičice, sekoiridoidnih glikozida, dalo je značajan doprinos proceni varijabilnosti analiziranih populacija kičice. Sadržaj svercijamarina, dominantnog sekoiridoidnog glikozida u nadzemnim delovima biljaka gajenih u uslovima staklare, pokazao se kao najznačajniji faktor međupopulacione varijabilnosti kičice. Uz to, pokazana je značajna korelacija između sadržaja sekoiridoidnih glikozida i genetičke sličnosti populacija, korišćenjem oba tipa molekularnih markera, s tim što je snažnija korelacija primećena u slučaju TRAP markera. Predstavljena procena genetičkog i fitohemijskog diverziteta kičice daju osnovu za eventualnu zaštitu ukupnog biodiverziteta ove vrste na Balkanskom poluostrvu, kao i za odabir genotipova za zasnivanje i unapređenje njene plantažne proizvodnje.

Centaury (Centaurium erythraea Rafn) is a medicinal and pharmacologically attractive plant species which has a wide range of biological activity. The main objective of presented study was to estimate genetic and phytochemical diversity of centaury within the Balkan Peninsula. With that purpose, seed collection of natural centaury populations was established. The study included 43 populations of C. erythraea, among which 41 originated from the Balkan Peninsula. Molecular marker techniques, such as RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA) and TRAP (Target Region Amplification Polymorphism) were optimized to investigate the genetic diversity among these populations. DNA used in these analyses originated from in vitro grown plants to ensure the authenticity of centaury DNA by eliminating the possibility of its contamination by extraneous DNA. To acquire sufficient informational characters, 16 decameric primers were applied in RAPD assays, which produced 408 different PCR products, while TRAP assays included the combinations of 3 specific and 3 arbitrary primers, resulting in 767 fragments of DNA. Specific primers used for TRAP analyses were constructed according to the RNA sequences, showing high homology with DNA sequences published in electronic data bases for following enzymes: geraniol 10-hydroxylase, cytochrome P450 reductase and secologanin synthase. Molecular markers provided a high percentage of polymorphism. The informativeness of single primers (RAPD) of primer combinations (TRAP) was confirmed by various parameters. Low within-population genetic variability of natural populations of centaury could be explained by the high levels of selfing or geitonogamy in the process of fertilization and by strong genetic drift. Due to the fact that centaury grows in small, fragmented populations and that gene flow between them probably does not exist, a high genetic differentiation of analyzed populations was expected and this was confirmed by molecular markers. Moreover, molecular markers Резиме/Summary efficiently differentiated diploid populations from tetraploids. Tetraploid populations were clearly clustered into groups related to their geographic origin, especially when RAPD markers were analyzed. Genetic similarity data between the Balkan Peninsula populations, obtained with either RAPD or TRAP markers, significantly correlated with the geographic distances between localities of their origin. Identification and quantification of secondary metabolite compounds, secoiridoid glycosides, highly contributed to the estimation of diversity of centaury populations in the analyzed region. A dominant secoiridoid glycoside in aerial parts of plants grown under greenhouse conditions was swertiamarin, which pointed to the interpopulation variability of centaury. Furthermore, a significant correlation between the secoiridoid glycosides content and genetic similarity of populations has been obtained, though a higher correlation was recorded for TRAP markers. The genetic and phytochemical diversity estimation of centaury from the Balkan Peninsula provides a basis for future biodiversity conservation efforts and also for high-productive genotype selection and field production improvement.