Mehanizam zaštitnog dejstva arilpiperazinskih liganada za dopaminske D2 receptore u azot monoksidom i 6-hidroksidopaminom izazvanoj smrti SH-SY5Y ćelija humanog neuroblastoma

Abstract

U ovom radu je ispitivan uticaj 20 novosintetisanih arilpiperazinskih dopaminergičkih liganada na vijabilnost humanih SH-SY5Y neuroblastomskih ćelija tretiranih donorom azot monoksida (engl. nitric oxide, NO) natrijum nitroprusidom (engl. sodium nitroprusside, SNP) i uzročnikom oksidativnog stresa dopaminergičkim neurotoksinom 6-hidroksidopaminom (6-OHDA). Supstanca koje je pružala najjaču zaštitu od donora NO je bio N-{4-[2-(4-fenil-piperazin-1-il)-etil]-fenil}-pikolinamid (arilpiperazin 6a), dok je N-{3-[2-(4-fenil-piperazin-1-il)-etil]-fenil}-pikolinamid (arilpiperazin 6b) najefikasnije štitio humanu neuroblastomsku ćelijsku liniju SH-SY5Y od 6-OHDA. Arilpiperazin 6a je delimično sprečavao povećanje sadržaja superoksid anjon radikala, smanjenje potencijala membrane mitohondrija i unutarćelijskog sadržaja adenozin-trifosfata (ATP), aktivaciju kaspaza i sledstvenu fragmentaciju DNK koje je izazivao NO. Uočeno smanjenje unutarćelijske koncentracije superoksida nije bilo posledica direktne interakcije ispitivanog arilpiperazina sa O2 -∙, niti je supstanca 6a uticala na akumulaciju NO unutar ćelije. Arilpiperazin 6a je sprečavao inhibiciju protektivnog Akt, kao i aktivaciju proapoptotskih ERK, JNK i AMPK signalnih puteva izazvane SNP-om, ukazujući na bitnu ulogu ovih molekula u njegovom zaštitnom delovanju. Potencijalni značaj arilpiperazina 6a u sprečavanju neurodegenerativnih/neurozapaljenskih procesa posebno naglašava činjenica da je štitio neuronima slične SH-SY5Y ćelije i od citotoksičnog efekta NO-a poreklom od stimulisanih makrofaga. Slično, arilpiperazin 6b je sprečavao povećanje unutarćelijskog sadržaja superoksid anjon radikala (O2 -∙), smanjenje potencijala membrane mitohondrija i posledične apoptotske događaje – aktivaciju kaspaza i fragmentaciju DNK – koje je izazivao 6-OHDA. Stabilizacija potencijala mitohondrijalne membrane pod dejstvom arilpiperazina 6b se vremenski poklapala sa smanjenjem unutarćelijskog sadržaja O2 -∙, što ukazuje da je supstanca 6b inhibirala oslobađanje superoksida iz oštećenih mitohondrija stabilizacijom potencijala njihove membrane. Arilpiperazin 6b nije pokazao značajnu sposobnost direktnog uklanjanja superoksid anjon radikala. Zaštitni mehanizam supstance 6b nije uključivao interakciju sa JNK i ERK proapoptotskim putevima, koje je aktivirao 6-OHDA. Međutim, arilpiperazin 6b je izazvao dodatnu prolaznu aktivaciju preživljavajućeg Akt signalnog puta u ćelijama tretiranim 6-OHDA-om, pa se ne može isključiti doprinos Akt-a antiapoptotskom efektu arilpiperazina 6b. Pored apoptoze, 6-OHDA je izazivao i citotoksičnu autofagiju u SH-SY5Y ćelijama smanjujući aktivnost ključnog inhibitora autofagije u ćeliji − mTOR proteina. Arilpiperazin 6b je delimično sprečavao inhibiciju aktivnosti mTOR-a i posledičnu autofagiju zabeležene u prisustvu 6-OHDA. Ovaj efekat arilpiperazina 6b je bio nezavisan od aktivnosti pozitivnog regulatora autofagije AMPK. Iako su oba arilpiperazina pokazivala parcijalnu agonističku aktivnost na D2 receptorima njihov neuroprotektivni efekat je bio nezavisan od vezivanja za dopaminske receptore, jer ga visokoafinitetni blokatori D1/D2 receptora butaklamol (u slučaju 6a) ili selektivni blokator D2 receptora sulpirid (u slučaju 6b) nisu poništavali. Ovi rezultati ukazuju da arilpiperazini predstavljaju dobre kandidate za razvoj potencijalnih neuroprotektivnih lekova.

We investigated the protective ability of 20 novel arylpiperazine-based dopaminergic ligands against nitric oxide (NO) and dopaminergic neurotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-mediated neurotoxicity. The most potent neuroprotective compound against NO-induced toxicity was N-{4-[2-(4-phenylpiperazin- 1-yl)-ethyl]-phenyl}-picolinamide (arylpiperazine 6a), while N-{3-[2-(4- phenyl-piperazin-1-yl)-ethyl]-phenyl}-picolinamide (arylpiperazine 6b) most effectively protected SH-SY5Y human neuron-like cells from 6-OHDA-generated oxidative injury. Arylpiperazine 6a diminished the proapoptotic action of NO donor sodium nitroprusside (SNP) by decreasing superoxide anion content, mitochondrial membrane depolarization, decline in intracellular adenozine-triphosphate (ATP) content, caspase activation and subsequent phosphatydilserine externalization/DNA fragmentation. The observed decrease of intracellular superoxide concentration was not mediated by direct O2 -∙ scavenging. Arylpiperazine 6a did not interfere with NO accumulation within the cell. The protective effect of arylpiperazine 6a in NO-induced stress was associated with activation of anti-apoptotic (Akt) and the inhibition of proapoptotic (JNK, ERK, AMPK) signaling pathways. A potential therapeutic value of the arylpiperazine 6a in neurodegenerative/neuroinflammatory diseases prevention was additionally supported by the ability of this arylpiperazine to protect SH-SY5Y neuronlike cells from macrophage-derived NO. Similarly, arylpiperazine 6b prevented 6-OHDA-induced increase in superoxide anion content, mitochondrial membrane depolarization and following apoptotic related events – caspase activation and DNA fragmentation. The stabilization of 6-OHDA-disrupted mitochondrial membrane potential by arylpiperazine 6b correlated with the decrease in intracellular superoxide anion (O2 -∙) content, suggesting that decline in O2 -∙ concentration resulted from mitohondrial membrane stabilization. Arylpiperazine 6b did not posses significant O2 -∙ scavenging ability. The mechanism underlying the protection provided by the compound 6b was independent of JNK- and ERK-proapoptotic pathways, as 6-OHDA-provoked activation of these proapototic pathways was not modified by arylpiperazine 6b. However, arylpiperazine 6b caused additional transient activation of pro-survival Akt signaling pathway in 6-OHDA-treated cells, which probably contributed to its anti-apoptotic effect. In addition to apoptosis, 6-OHDA induced deleterious autophagy in SH-SY5Y cells by silencing the activity of mTOR, a key autophagy inhibitor in the cell. Arylpiperazine 6b partialy prevented 6-OHDA-triggered decrease of mTOR activity and autophagy in AMPK-independent manner. Although both compounds showed partial agonist activity on hD2 receptors, their neuroprotective action was independent of dopamine receptor binding, as it was not affected by the high-affinity D1/D2 receptor blocker butaclamol (6a) or selective D2 receptor blocker sulpiride (6b). These results support further study of arylpiperazines as potential neuroprotective drugs.