Parametri antioksidacionog sistema u tkivima žaba Pelophylax esculentus kompleksa kao biomarkeri izlaganja metalima

Abstract

Organizmi su u životnoj sredini izloženi različitim zagađivačima i sredinskim faktorima. Metali su obeleženi kao rastući problem zbog svoje postojanosti i toksičnosti. Oksidacioni stres je jedan od glavnih načina delovanja metala na organizme. Redoks aktivni (Cu, Co, Cr, Fe, Ni i Zn) metali izazivaju direktno oksidacioni stres kroz Fentonovu i Haber-Vajsovu reakciju, dok redoks neaktivni metali (As, Cd, Hg i Pb) indirektno dovode do oksidacionog stresa kroz promenu aktivnosti antioksidacionog sistema (AOS). Pelophylax esculentus hibridni kompleks se sastoji od tri vrste semiakvatičnih žaba (od roditeljskih vrsta Pelophylax ridibundus i Pelophylax lessonae i njihovog hibrida Pelophylax kl. esculentus) koje koegzistiraju i mogu da stupaju u reproduktivne odnose. Žabe su zbog svojih životnih karakteristika (složen životni ciklus, polupropustljiva koža, prisutnost u vodenoj i terestričnoj sredini) podložne akumulaciji metala preko vode i kroz lanac ishrane i zato predstavljaju potencijalno dobre bioindikatore. Ciljevi ove doktorske disertacije su bili utvrđivanje razlika u bioakumulaciji metala, aktivnosti i koncentracijama parametara antioksidacionog sistema i aktivnosti holinesteraze u tkivima jetre, kože i mišića vrsta P. esculentus kompleksa sa četiri različita lokaliteta, zatim promene parametara antioksidacionog sistema pod uticajem različitih koncentracija akumuliranih metala, i na kraju potencijalna upotreba ovih parametara kao biomarkera efekata metala. Lokaliteti sa kojih su žabe izlovljavane su: jezero Popovica u okviru Nacionalnog parka “Fruška gora”, Specijalni rezervat prirode “Obedska Bara”, Park prirode “Ponjavica” i Veliki Bački kanal kao deo kanala Dunav-Tisa-Dunav. Parametri antioksidacionog sistema koji su analizirani u okviru enzimskih komponenti su: superoksid-dismutaza (SOD), katalaza (CAT), glutation-peroksidaza (GSH-Px), glutation-reduktaza (GR), enzim faze II biotransformacije glutation-S-transferaza (GST), a od neenzimskih komponenti: ukupni glutation (GSH) i slobodne sulfhidrilne grupe (SH). Određivana je i koncentracija metala (As, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Zn) u tkivima i vodi. Rezultati bioakumulacije metala u tkivu jetre, kože i mišića vrste Pelophylax esculentus kompleksa pokazali su da je vrsta P. ridibundus akumulirala najveće količine metala, a zatim slede P. esculentus i P. lessonae. Razlike u bioakumulaciji metala mogu se povezati sa životnim navikama, hibernacijom, izborom plena i veličinom tela ovih vrsta. P. ridibundus je najkrupnija i uvek hibernira u vodi, dok ostale dve vrste imaju sitnije telo, drugačiji diverzitet plena i/ili hiberniraju na kopnu. Od svih ispitivanih parametara antioksidacionog sistema, enzimi SOD, GSH-Px i koncentracija SH grupa pokazali su najveću varijabilnost kod vrsta Pelophylax esculentus kompleksa. Dok je odnos enzima CAT i GSH-Px u jetri odvojio P. esculentus od roditeljskih vrsta. P. esculentus je imala veću aktivnost CAT i značajno manju aktivnost GSH-Px u odnosu na P. ridibundus i P. lessonae. Dobijeni rezultati ukazuju na to da se pored različitih interakcija sa spoljašnom sredinom (razlike u akumulaciji metala) i fizioloških razlika (u bazalnom metabolizmu) vrste ovog kompleksa razlikuju i u parametrima antioksidacionog sistema. Ispitivanje međutkivnih razlika u parametrima AOS, aktivnosti holinesteraze i akumulaciji metala između jetre, kože i mišića vrsta P. esculentus kompleksa pokazalo je da jetra ima najveće vrednosti ispitivanih parametara, kao i da akumulira najveći broj i najveće koncentracije metala (posebno izraženo u koncentracijama Fe, Cu, Al, Cd, Hg, i Ni). Zatim sledi koža, dok su najniže vrednosti AOS parametara i koncentracije metala zabeležene u mišićima. Efekti različitih lokaliteta na vrste P. esculentus kompleksa pokazuju da se koncentracije akumuliranih metala u tkivima razlikuju od koncetracija metala izmerenih u vodi, što ukazuje da postoji povremeno zagađenje, ili su metali u tkiva dospeli na neki drugi način (npr., ishranom preko plena, ili su u nekom trenutku u toku svog životnog ciklusa bile izložene povećanim koncentracijama metala). Opšti trend je da povećanje zagađenja prati i veća akumulacija metala u tkivima žaba, dok se kod parametara AOS ne uočava jasan obrazac promene. Odnos koncentracija metala i parametara AOS pokazuje da vrsta P. esculentus ima najveći broj Pirsonovih korelacija, zatim sledi P. ridibundus, dok je najmanji broj korelacija zabeležen kod P. lessonae. Redoks aktivni metali koji pokazuju najveći efekat na ispitivane parametre kod žaba su: Cr, As, Ni, Fe i Cu, a redoks neaktivni: Hg i Cd. Među parametrima AOS najveći broj korelacija sa metalima pokazuju SH grupe, zatim SOD i GR. Od svih parametara antioksidacionog sistema koji se koriste kao biomarkeri, tri navedena (SH grupe, SOD i GR) se izdvajaju kao vrlo efikasni u biomonitoringu efekta različitih metala na tkiva žaba P. esculentus kompleksa. Aktivnost holinesteraze kao parametar neurotoksičnosti pokazao je promene koje su u direktnoj vezi sa promenama koncetracija akumuliranih metala, i to pozitivne sa Al, Zn i Cu i negativne sa As i Hg. Ovo ukazuje da se i ChE može koristiti kao biomarker u studijama koje prate prisustvo i efekte metala kod žaba. Istraživanja sprovedena u ovoj doktorskoj disertaciji pokazala su da se vrste P. esculentus kompleksa razlikuju u akumulaciji metala i parametrima antioksidacinog sistema, kao i da se ispitivani parametri mogu koristiti kao biomarkeri izlaganja i efekata metala. Na osnovu svega što je zabeleženo može se zaključiti da su vrste P. esculentus kompleksa pogodni bioindikatori prisustva i efekta metala u životnoj sredini.

Organisms are exposed to different environmental factors and contaminants. Metals are marked as a major problem due to their ubiquitous and toxicity. The oxidative stress has been suggested as one of the main mechanisms of metal toxicity effects on organisms. The redox active metals (Fe, Cu, Cr and Ni), induce oxidative stress directly through the Fenton and Haber-Weiss reactions, while the redox inactive metals (Cd, Pb, Zn, and Hg) act indirectly through alterations of the antioxidant defense system (AOS). The Pelophylax esculentus hydride complex is comprised of three semiaquatic frog species (parent species Pelophylax lessonae and Pelophylax ridibundus and their hybrid Pelophylax kl. esculentus) that coexist and can crossbreed. Frogs are distinguished by a number of properties (biphasic life- aquatic and terrestrial, complex life cycle and semipermeable skin) that make them highly susceptible to metal accumulation trough water and food chain and are therefore potentially useful bioindicator species. The aims of this doctoral dissertation were to determine: differences in metals bioaccumulation, activities and concentration of antioxidative defense system parameters and activity of cholinesterases in the liver, skin and muscle tissues of P. esculentus complex species from four localities; the changes in antioxidative defense system parameters and activity of cholinesterases induced by different metals concentration, and in the end potential usefulness of examined parameters as biomarkers of metals effects. Frogs were caught from next localities: Lake Popovica as a part of National Park “Fruška Gora”, Special Nature Reserve "Obedska Bara", Nature Park "Ponjavica" and the Grand Canal as part of the Danube-Tisa-Danube canal. Analyzed parameters of antioxidative defense system included enzymatic components: activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px), glutathione reductase (GR), enzyme of phase II biotransformation glutathione-S-transferase (GST), and non-enzymatic components: the concentration of glutathione (GSH) and free sulfhydryl groups (SH). The concentrations of metals (As, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Zn) were measured in the water and tissues. The results of metals accumulation in liver, skin and muscle of P. esculentus complex frogs showed that P. ridibundus accumulated highest concentrations of metals, then P. esculentus and P. lessonae. Differences in metals accumulation of examined frogs could be related with some interspecies differences in life history, hibernation, prey diversity and body size. P. ridibundus is the largest and always hibernate in water, while other two have smaller body, different prey diversity and/or hibernate on land. Among the all examined AOS parameters, enzymes SOD, GSH-Px and concentration of SH groups displayed the highest level of variability. Relationship between activities of CAT and GSH-Px in liver denoted of hydride P. esculentus from its parental species. P. esculentus had higher activity of CAT and lower activity of GSH-Px in comparison to P. ridibundus and P. lessonae. The results indicate that beside differences in interaction with environment and in some physiological processes the species of this complex also differ in parameters of AOS. Intertissue differences in AOS, cholinesterase activity and metals accumulation between liver, skin and muscle of P. esculentus frogs point out liver as tissue with highest values of all parameters and highest number and concentration of metals, then followed by skin and the lowest were for muscle. The effects of different localities on P. esculentus comlpex species revealed that the concentrations of metals in tissues and water differ, this can be the result of the exposure of frogs to elevated concentrations of metals in the past, and/or to indirect accumulation of these elements via food intake. The general trend showed that the increased locality pollution is in compliance with increased metal accumulation, this trend was not observed for changes in AOS. Relationship between concentration of metals and AOS parameters showed that P. esculentus exhibited the highest number of correlations, this was followed by P. ridibundus and by P. lessonae which exhibited the lowest number of correlations. The highest effects on frogs antioxidative defense system had next redox active metals: Cr, As, Ni, Fe i Cu, and redox inactive metals: Hg i Cd. The highest number of correlations were determined for the following biomarkers: SH groups, SOD and GR. This parameters (SH groups, SOD and GR) can be used as biomarkers of metal pollution-induced oxidative stress in frogs tissues. Cholinesterase activity correlated with concentration of metals, positively with Al, Zn and Cu and negatively with As and Hg, this indicate that cholinesterase could be included in biomonitoring studies of metals effects. Research conducted in this doctoral dissertation showed: that the species of P. esculentus complex differ in concentration of accumulated metals and antioxidative defense system parameters; and that used parameters can be good biomarkers of exposure and effects of metals. In the light of these findings we can suggest the use of P. esculentus complex species as a biomonitoring species in studies of metal accumulation and metal-induced oxidative stress.