Uloga arabinogalaktanskih proteina u procesu morfogeneze in vitro kod kičice (Centaurium erythraea Rafn.)
The role of arabinogalactan proteins in centaury (Centaurium erythraea Rafn.) morphogenesis in vitro
Апстракт:
Kičica (Centaurium erythraea Rafn.) je biljna vrsta širokog spektra lekovitih
dejstava, koja se odlikuje visokom regenerativnom sposobnošću u uslovima in vitro
kulture. Osnovni cilj disertacije bio je izučavanje pojedinih biohemijskih i molekularnih
aspekata in vitro morfogeneze kičice sa svrhom rasvetljavanja osnova razvojne
plastičnosti ove biljne vrste koja se ispoljava u uslovima in vitro kulture. U ovom
istraživanju je in vitro morfogeneza kičice indukovana iz odsečaka listova na svetlosti i
u mraku. Na hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja i na svetlosti odvijao se proces
direktne organogeneze pupoljaka, a u mraku proces direktne rizogeneze. Regeneracija
biljaka putem indirektne somatske embriogeneze (SE) je postignuta na hranljivim
podlogama sa regulatorima rastenja 2,4-D i CPPU i na svetlosti i u mraku, dok je na
istim podlogama, za regeneraciju pupoljaka indirektnom organogenezom, svetlost bila
obligatorni faktor. Anatomska istraživanja su pokazala da je razvoj somatskih embriona
bio asinhron, a na svetlosti se odvijao simultano sa razvojem adventivnih pupoljaka. U
ovim istraživanjima je uspostavljen model-sistem pogodan za komparativnu analizu in
vitro morfogenetskih procesa kod kičice na molekularnom i biohemijskom nivou.
Ispitana je ukupna aktivnost antioksidativnih enzima, superoksid dismutaza (SOD),
katalaza (CAT) i peroksidaza (POX), kao i zastupljenost i aktivnost pojedinih izoformi
ispitivanih enzima tokom različitih morfogenetskih procesa. Analize su pokazale da su
SOD i CAT uključene u antioksidativnu zaštitu listova kičice od oštećenja izazvanih
povredom, do koje dolazi prilikom izolovanja eksplantata, dok je totalna aktivnost POX
bila snažno indukovana tokom morfogeneze na svim ispitivanim hranljivim podlogama.
Uloga arabinogalaktanskih proteina (AGP), proteina ćelijskog zida bogatih
hidroksiprolinom, tokom različitih morfogenetskih procesa in vitro kičice istražena je
primenom nekoliko pristupa. Dodavanje β-D-glukozil Yariv reagensa (βGlcY), koji
specifično vezuje i precipitira AGP i na taj način sprečava AGP da obave svoju
funkciju, u hranljive podloge dovelo je do smanjenja broja somatskih embriona i
adventivnih pupoljaka po eksplantatu. Uporednom analizom je nađeno da se ispitivani
morfogenetski procesi razlikuju po svojoj osetljivosti na βGlcY, te da se po rastućoj
senzitivnosti mogu poređati kao: direktna rizogeneza (neosetljiva) < indirektna
organogeneza pupoljaka < direktna organogeneza pupoljaka << indirektna SE (veoma
osetljiva). Količina AGP, određena metodom radijalne difuzije, povećavala se tokom
indukcije različitih morfogenetskih procesa. Metodom ukrštene elektroforeze je
pokazano da su različiti morfogenetski procesi praćeni sintezom različitih setova AGP.
Korišćenjem monoklonalnih antitela LM2, JIM4 i JIM13, specifičnih za ugljenohidratne
delove AGP molekula, imunohistohemijski su lokalizovani specifični AGP
epitopi u ćelijskom zidu i pokazana njihova razvojna regulacija tokom SE. Polazeći od
sekvenciranog i rekonstruisanog transkriptoma korena i lista kičice, identifikovana su
četiri AGP transkripta, označena kao CeAGP1 – 4. Sekvence ovih transkripata su
potvrđene direktnim sekvenciranjem, dok je bioinformatičkom analizom pokazano da
CeAGP1, CeAGP2 i CeAGP4 kodiraju AGP sa fasciklinskim domenima (FLA), dok je
CeAGP3 AG-peptid sa konzervisanim DUF1070 domenom. Analizom ekspresije ovih
gena qRT-PCR metodom je pokazano da se CeAGP1 specifično indukuje tokom
indirektne SE, dok se CeAGP3 eksprimira tokom morfogeneze na svim hranljivim
podlogama.
U ovom radu je kičica po prvi put predložena kao odličan model-organizam u biologiji
razvića biljaka, koji je pogodan za proučavanje biohemijskih i molekularnih aspekata in
vitro morfogeneze. Dobijeni podaci o ulozi antioksidativnih enzima i AGP proteina
tokom morfogeneze kičice in vitro predstavljaju prve rezultate istraživanja morfogeneze
na biohemijskom i molekularnom nivou kod ove vrste.
Кључне речи:
Centaurium erythraea Rafn.; Kultura in vitro; Organogeneza; Somatska embriogeneza; Antioksidativni enzimi; Arabinogalaktanski proteini; Β-D-glukozil Yariv reagens; Imunohistohemija; FLA; DUF1070Извор:
University of Belgrade, Faculty of Biology, 2015, 1-181Финансирање / пројекти:
URI
http://eteze.bg.ac.rs/application/showtheses?thesesId=2318https://fedorabg.bg.ac.rs/fedora/get/o:10231/bdef:Content/download
http://vbs.rs/scripts/cobiss?command=DISPLAY&base=70036&RID=47522319
http://nardus.mpn.gov.rs/123456789/4174
https://radar.ibiss.bg.ac.rs/handle/123456789/2812