Elongacioni faktor translacije 1A kod krompira (Solanum tuberosum L.): karakterizacija izoformi, ekspresija i uloga u odgovoru biljaka na toplotni stres

Abstract

Eukariotski elongacioni faktor translacije 1A (eEF1A) je citosolni, multifunkcionalni protein koji ima ključnu ulogu u elongacionoj fazi tokom sinteze proteina, vršeći transport aa-tRNK do mesta A na ribozomima. Pored osnovne funkcije, ovaj elongacioni faktor može učestvovati i u eksportu molekula iz nukleusa, organizaciji citoskeleta, proteolitičkoj degradaciji proteina, kao i posedovati aktivnost molekularnog šaperona. U ovoj tezi ispitan je uticaj visoke temperature na proces tuberizacije, rastenje i razviće, kao i ekspresiju eEF1A u izdancima, listovima i krtolama kod različitih sorti krompira gajenih u kontrolisanim uslovima ili u polju. Pored toga, urađena je i karakterizacija izoformi eEF1A u listovima kod različitih sorti krompira gajenih ex vitro ili u polju. Kod različitih sorti krompira izvršena je procena broja kopija gena koji kodiraju eEF1A, a ekspresija eEF1A gena u uslovima visoke temperature je ispitana kod sorti Désirée i Festival. Analiza zastupljenost eEF1A u mikro- i minikrtolama kod toplotno-osetljive sorte Désirée, je pokazala da u uslovima dugotrajnog toplotnog stresa dolazi do smanjenja zastupljenosti eEF1A, dok sa druge strane kod toplotno-tolerantne sorte Festival, dolazi do povećanja zastupljenosti eEF1A, kako u mikrokrtolama, tako i u starijim minikrtolama. Ovaj rezultat ukazuje na ulogu eEF1A u ublažavanju negativnog uticaja visoke temperature na proces tuberizacije kod krompira. Značajna korelacija ustanovljena je između zastupljenosti eEF1A u listovima krompira gajenih u polju tokom dve izuzetno tople godine (2011. i 2012.) i prinosa krompira. Rezultati eksperimenata u uslovima ex vitro, kao i polju, su pokazali da je relativna molekulska masa eEF1A krompira 49,2 kDa i da ima 5-8 izoformi. Povećanoj zastupljenosti eEF1A u uslovima visoke temperature, najviše su doprinela 2-3 polipeptida/izoforme iz bazne grupe. Genomska analiza je ukazala na postojanje više gena koji kodiraju eEF1A kod krompira, kao i da se ispitivane sorte razlikuju po broju kopija gena. Analiza ekspresije eEF1A gena u minikrtolama toplotno-osetljive sorte Désirée pokazala da je ekspresija većine gena osetljiva na delovanje visoke temperature, te dolazi do značajnog smanjenjenja broja većine eEF1A transkripata u uslovima toplotnog stresa. Sa druge strane, kod toplotno-tolerantne sorte Festival, visoka temperatura je imala blaži efekat na ekspresiju većine eEF1A gena, odnosno zastupljenost pojedinih transkripata se blago povećala ili ostala na nivou kontrole u uslovima visoke temperature. Izuzetak je predstavljao transkript eEF1A-12 gena koji se karakterisao izuzetnom inducibilnošću. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da ekspresija gena eEF1A-12 u uslovima visoke temperature najviše doprinosi povećanju zastupljenosti eEF1A proteina u krtolama toplotno-tolerantne sorte Festival, što otvara mogućnost za njegovo korišćenje u kreiranju novih, termotolerantnih sorti krompira putem klasičnih metoda selekcije ili metoda genetičkog inženjeringa.

Eukaryotic elongation factor 1A (eEF1A) is a cytosolic, multifunctional protein that plays a central role in the elongation phase of translation by delivering aa-tRNA complex to the A site of the ribosome. The eEF1A is also implicated in the nuclear export of aa-tRNA, organization of the cytoskeleton, participates in proteolysis, and possess chaperone activity. In this thesis, the effects of high temperatures on tuberization, growth, and development, as well as the expression and accumulation of eEF1A in shoots, leaves, and tubers, were investigated in different potato cultivars grown in a controlled environment and field. In addition, the characterization of eEF1A isoforms in leaves of different potato cultivars grown ex vitro or in the field was done. Also, in different potato cultivars, the number of eEF1A-coding genes, as well as the eEF1A genes' transcript expression under a high-temperature treatment, were investigated. Investigation of eEF1A accumulation in micro- and minitubers of heat-sensitive cultivar Désirée revealed a lower level of eEF1A under prolonged heat-stress, while in heat-tolerant cultivar Festival, a higher level of eEF1A in microtubers and older minitubers was found. Also, a significant positive correlation between eEF1A abundance in potato leaves and the potato productivity in the field was observed in two extremely hot years 2001. and 2012. These results indicate an important eEF1A role in mitigation of the adverse impacts of high temperature on the tuberization in potato. Results from ex vitro and field experiments have shown that potato eEF1A is a protein of 49.2 kDa with multiple isoforms (5-8). Increase in eEF1A abundance under high-temperature condition was mainly due to 2-3 basic polypeptides/isoforms. Genomic analysis indicated the existence of multiple genes encoding eEF1A in potato. Analysis of eEF1A genes' transcripts in minitubers of heat-sensitive cultivar Désirée revealed that expression of the most genes was sensitive to high temperature, and there was a significant reduction in number of eEF1A transcripts. On the other hand, in heat-tolerant cultivar Festival, high temperature had a milder effect on eEF1A gene-expression. The abundance of most eEF1A transcripts slightly increased or remained unchanged under high-temperature condition, with the exception of the eEF1A-12 transcript which was highly heat-inducible. Based on results obtained in this thesis, it can be concluded that eEF1A-12 gene expression mainly contributes to an observed increase in eEF1A abundance under high-temperature conditions in tubers of heat-tolerant cultivar Festival, which opens the possibility for its utilization in the development of new heat-tolerant potato varieties by classical breeding or genetic engineering.