Molecular structure, origin and function of B chromosomes in yellow-necked wood mouse Apodemus flavicollis(Mammalia, Rodentia)

Abstract

B hromozomi predstavljaju prekobrojne hromozome koji nisu neophodni za normalan rast i razviće. Ovi prekobrojni hromozomi se javljaju kod svih višećelijskih eukariotskih grupa, osim kod ptica, i različiti su po poreklu, morfologiji, veličini, broju, genetičkoj strukturi i efektima na fenotip. Njihova prisutnost u živom svetu procenjuje se na 3% kariotipski analiziranih vrsta. Karakteriše ih nasleđivanje koje ne prati Mendelova pravila, kao i izostanak rekombinacije sa hromozomima osnovnog A seta. Glavna pitanja koja se postavljaju u savremenim istraživanjima B hromozoma se odnose na njihovo poreklo, mehanizme nastanka i održavanja. Poznavanje genetičkog sadržaja, transkripcionog statusa i efekata prekobrojnih hromozoma, omogućuje rasvetljavanje njihovog biološkog značaja. Glodari su najbrojniji nosioci B hromozoma među sisarima. Rod Apodemus broji ukupno 20 vrsta, od kojih je kod šest zabeleženo prisustvo B hromozoma. U ovoj studiji izučavani su B hromozomi na jedinkama vrste žutogrli miš, Apodemus flavicollis. Nosioci imaju najčešće jedan ili dva B, dok je maksimalan zabeležen broj osam B hromozoma. Prekobrojni hromozomi se kod ove vrste javljaju u svim do sada proučavanim populacijama na teritoriji Republike Srbije, sa različitom učestalošću. Brojne populacione studije na ovoj vrsti pokazuju da jedinke sa B hromozomima imaju višu adaptivnu vrednost u poređenju sa jedinkama bez prekobrojnih hromozoma. Cilj ove studije bio je utvrđivanje sekvence, proučavanje porekla, kao i analiza transkripcione aktivnosti pojedinih sekvenci B hromozoma vrste A. flavicollis. U istraživanje su uključene životinje sa lokaliteta u Republici Srbiji, Ruskoj federaciji i Republici Belorusiji. Metodom mikrodisekcije iz kariotipa tri jedinke su izolovani B hromozomi koji su potom umnoženi u lančanoj reakciji polimeraze (PCR). Proizvedene su fluorescentne B-specifične probe. Procena homologije između B-specifičnih proba i hromozoma osnovnog kariotipa iste vrste izvršena je putem fluorescentne in situ hibridizacije (FISH). Utvrđena je homologija između sekvence B hromozoma i: a) pericentromernog regiona (PR) polnih hromozoma, b) subtelomernih regiona dva para malih autozoma, kao i c) slabija homologija sa distalnim regionom Y hromozoma. Homologija između sekvenci različitih B hromozoma je potvrđena bez obzira na geografsku udaljenost populacija iz kojih uzorci vode poreklo i nezavisno od broja B hromozoma u kariotipu. Ovo ukazuje na isto poreklo i/ili strukturu svih B hromozoma kod vrste A. flavicollis. U ovoj studiji je takođe pokazano da i pored česte zastupljenosti C-kit gena na B hromozomima različitih vrsta sisara, ovaj gen nije pronađen na B hromozomima vrste A. flavicollis. Poređenjem sekvenci B hromozoma sa referentnim genomom vrste Mus musculus, identifikovano je 39 gena sa 22 hromozomska regiona koja vode poreklo sa 16 hromozoma referentnog genoma. Sa izuzetkom B hromozoma poreklom iz Ruske federacije, koji u sekvenci sadrži jedan dodatni hromozomski region koji nije nađen kod populacija iz Republike Srbije, rezultati pokazuju da su svi analizirani B hromozomi izgrađeni od istih regiona hromozoma A seta. Sekvenca B hromozoma je u najvećoj meri sadrži gene koji kodiraju proteine mikrotubula i ćelijskog ciklusa. Takođe su prisutni i geni koji kodiraju nukleotid-vezujuće, metal-vezujuće proteine kao i proteine membrane, identifikovan je i veliki broj repetitivnih sekvenci, među kojima su transpozoni u nekim slučajevima bili tandemski organizovani. Utvrđeno je i da se geni smešteni na B hromozomima nalaze u različitim stadijumima degradacije. Nasuprot višedecenijskom uverenju da su B hromozomi genetički inertni, u ovom istraživanju je pokazano da se pseudogeni poreklom sa B hromozoma transkribuju. Pored toga, neizmenjeni geni sa B hromozoma, ili sa osnovnog genoma, u prisustvu B hromozoma, pokazuju viši nivo transkripcije kod ženki u mlađem životnom dobu. Transkripcija gena Cenpe je povezana i sa brojem B hromozoma, tako da je nivo transkripcije najviši kod jedinki koje imaju jedan B hromozom. B hromozomi vrste A. flavicollis, najverovatnije vode poreklo od pericentromernog regiona X hromozoma koji se nalazi neposredno uz pseudoautozomalni region, odlikuju se stabilnom genetičkom strukturom na širokom arealu vrste, transkripciono su aktivni na način koji je povezan sa polom, starošću i brojem B hromozoma u kariotipu.

B chromosomes (Bs) are supernumerary chromosomes in a standard karyotype, unnecessary for normal growth and development. Bs are present in all main groups of multicellular eukaryotes, except birds, and extremely variable considering origin, morphology, size, number, molecular structure, and phenotypic effects. 3% of all analyzed species have B chromosomes. The Bs do not follow rules of Mendelian segregation law and do not recombine with members of the basic A chromosome complement. The main questions considered in contemporary studies of Bs are surrounding their origin, mechanisms of formation and maintenance. Knowledge of their molecular structure, transcriptional activity, and phenotypic effects, will allow a deeper understanding of their biological importance. Within mammals, the most frequent carriers of Bs are rodents. The genus Apodemus includes 20 species, six of which carry Bs, in addition to A chromosome set. In this study, B chromosomes were analyzed in specimens of the yellow-necked mouse, Apodemus flavicollis. Carriers usually have one or two Bs, and the highest recorded number in this species is eight B chromosomes. In different frequencies, supernumeraries are present in all studied populations of A. flavicollis in the territory of the Republic of Serbia. Numerous population studies of this species are indicating that B carriers have a higher fitness compared to individuals without B chromosomes. The aim of this study was to define sequence, origin and transcriptional activity of selected B regions in species A. flavicollis. Specimens were collected from different localities in the Republic of Serbia, Russian Federation and the Republic of Belarus. B chromosomes have been isolated by microdissection from the karyotype of three individuals and amplified in the polymerase chain reaction (PCR). B-specific fluorescent probes were synthesized. Estimation of homology between B-specific probes and chromosomes of A set had been obtained by fluorescent in situ hybridization (FISH). Homology was shown between the B chromosome and: a) pericentromeric region (PR) of sex chromosomes b) subtelomeric region of the two pairs of small chromosomes and c) lower homology with the distal region of the Y chromosome. Despite the distinct geographical origin of samples and different number of Bs in karyotypes, hybridized probes showed the same affinity to Bs. This indicates the same origin and/or structure of all Bs in A. flavicollis. This study has demonstrated that C-kit gene does not contribute to the composition of supernumeraries in A. flavicollis, contrary to the studies of Bs in numerous mammalian species. Comparing sequences of Bs and referent genome of the species Mus musculus, 39 genes in 22 chromosomal regions that originate from 16 chromosomes of the referent genome have been identified. With the exception of one region present on B chromosome from Russian Federation, that contained one additional chromosomal region not present on the samples from Serbian populations, results demonstrate that all analyzed Bs are composed of the same A-chromosomes’ regions. B chromosomes are rich in microtubule and cell cycle protein-coding genes. Other present categories include genes that are coding nucleotide-binding, membrane, and metal-binding proteins, as well as a high amount of repetitive elements. Transposable elements were tandemly arranged in some cases. Genes present on B chromosomes are at different stages of degradation. In contrast to the view accepted for many decades that Bs are genetically inert elements, this study demonstrates that pseudogenes on Bs are transcribed. The study also demonstrates that Bs-genes, or standard-genome genes in the presence of Bs, show higher transcriptional levels in young females. Furthermore, transcription of Cenpe gene is linked with the number of Bs, in the manner that samples with one B show the highest transcription level. B chromosomes in A. flavicollis probably originate from the pericentromeric region of the X chromosome which is positioned near pseudoautosomal region, they are featured with stable genetic structure throughout the whole areal of the species and are transcriptionally active depending on the sex, age and number of Bs.