Uloga sekoiridoidnih glukozida i beta-glukozidaze u odbrambenom odgovoru kičice (Centaurium erythraea Rafn) na stres povređivanjem

Abstract

Centaurium erythraea Rafn (kičica) je bogat izvor farmakološki značajnih specijalizovanih metabolita, uključujući fenolne kiseline, flavonoide i, u najvećoj meri sekoiridoide. Sekoiridoidni glukozidi su monoterpenoidni molekuli čiji se skelet zasniva na ciklopentan-C-piranu za koji je, na poziciji C1 vezan molekul β-D glukoze. Ova jedinjenja podležu enzimatskoj hidrolizi u reakciji sa enzimom β-glukozidazom, pri čemu se oslobađaju odgovarajući aglikoni koji se dalje uključuju u metaboličke procese biljke. Biosinteza i razgradnja sekoiridoida kod kičice su koordinisani procesi koji obezbeđuju konstitutivno prisustvo ovih gorkih materija u tkivima biljke, a čija je primarna uloga odbrana od patogena i herbivora. Kao odgovor na stres povređivanjem u listovima kičice dolazi do intenzivnije akumulacije sekoiridoida, što je rezultat kako pojačane ekspresije većine biosintetskih gena, tako i snižene ekspresije -glukozidaze koja katalizuje prvi korak njihove razgradnje. Koordinisana ekspresija biosintetskih gena uključenih u metabolizam sekoiridoida regulisana je na transkripcionom nivou i nalazi se pod uticajem signalnog puta jasmonske kiseline. Identifikovane su dve varijante enzima -glukozidaza (CeBGLU1 i CeBGLU2) kod kičice koje pokazuju visoku specifičnost ka sekoiridoidnim glukozidima kao supstratu. Hidrolitička funkcija enzima potvrđena je njihovom heterologom ekspresijom u organizmu domaćinu (Escherichia coli), prečišćavanjem rekombinantnih proteina i enzimatskim testovima izvedenim u uslovima in vitro. Rezultati doktorske disertacije pružaju osnovu za primenu metaboličkog inženjeringa u cilju komercijalne i održive proizvodnje sekoiridoida iz obnovljivih izvora.

Centaurium erythraea Rafn (centaury) is a rich source of pharmaceutically active specialized metabolites including phenolic acids, flavonoids and especially secoiridoids. Secoiridoid glucosides are monoterpenoids based on a cyclopentan-C-pyran skeleton with the β-D glucose linked at C1 position. These compounds are subjected to hydrolysis catalyzed by enzymes β-glucosidases, and resulting aglycones could be subsequently directed towards different metabolic pathways in plants. Coordinated metabolic processes, such as biosynthesis and catabolism of secoiridoid glucosides, ensure constitutive presence of these bitter taste compounds in plant tissue, which play a decisive role in the defense against pathogens and herbivores. Pronounced accumulation of secoiridoids in centaury leaves observed during the response of plants to mechanical wounding was preceeded by the strong induction of the majority of biosynthetic genes as well as by the down-regulation of β-glucosidase, which catalyses the first step of secoiridoid glucosides catabolism. The expression of secoiridoids biosynthetic genes during response to wounding appears to be coordinately up-regulated and controlled at the transcriptional level, through the jasmonate signalling pathway. Two centaury β-glucosidases (CeBGLU1 and CeBGLU2), showing high substrate specificity for secoiridoid glucosides, were identified. Hydrolytic function of the two enzymes was confirmed by heterologous expression of candidate genes in the host organism (Escherichia coli), purification of recombinant proteins, and in vitro enzymatic assays. The results of the doctoral dissertation provide the basis for the further application of metabolic