Sinergistički uticaj giberelina i svetlosti na indukciju somatske embriogeneze iz lateralnih korenova spanaća (Spinacia oleracea L.) in vitro
Synergistic effect of gibberellin and light on the induction of somatic embryogenesis from lateral roots of spinach (Spinacia oleracea l.) in vitro
Апстракт:
U ovom radu analiziran je uticaj giberelina (GA) i svetlosti na indukciju somatske embriogeneze iz apikalnih odsečaka korenova spanaća sorte „Matador“. Izolovani organi kultivisani su u uslovima in vitro na medijumu za indukciju somatske embriogeneze, koji je sadržao 20 μM α-naftil-sirćetnu kiselinu (NAA) i 5 μM giberelnu kiselinu (GA3). Velika varijabilnost u embriogenom potencijalu spanaća, koja je posebno izražena kod sorte „Matador“, otežava proučavanje delovanja drugih faktora na proces somatske embriogeneze. Analizom embriogenog potencijala nasumično izabranih klijanaca dobijenih isklijavanjem semena sorte “Matador” devet različitih evropskih proizvođača semena, uočeno je značajno variranje frekvence regeneracije (0-100%) između populacija i individua u okviru populacije, kao i prosečnog broja somatskih embriona (SE) po eksplantatu (0-14.4 po populaciji, odnosno 0-36 po eksplantatu pojedinačnih klijanaca). Rezultati ukazuju na važnost odabira biljnog materijala za eksperiment, jer on može značajno uticati na interpretaciju rezultata. Stoga je u ovom radu razvijena i uspešno korišćena metoda uzorkovanja biljnog materijala, izlaganjem jednakog broja odsečaka korenova svakog klijanca svim tretmanima u okviru eksperimenta, čime je prevaziđen uticaj varijabilnosti biljnog materijala usled genetičkih i drugih uticaja. U cilju ispitivanja mehanizma kojim GA3 indukuje proces somatske embriogeneze, testiran je uticaj paklobutrazola (PAC), inhibitora biosinteze GA i trihostatina A (TSA), inhibitora deacetilaze histona, na ovaj proces. Suprotno očekivanju, PAC je delovao sinergistički sa GA3 i NAA u stimulaciji somatske embriogeneze. U kombinaciji sa NAA+GA3, 1–10 M PAC je uticao na povećanje embriogenog potencijala, sa najvećim efektom pri 2.5 μM PAC. U kombinaciji sa NAA, koji sam po sebi nije dovoljan za indukciju somatske embriogeneze, bila je potrebna nešto viša koncentracija PAC za dostizanje značajnog embriogenog odgovora—10 M PAC za eksplantate nasumično izabranih klijanaca i 5 M PAC za eksplantate genetički predisponiranih jedinki prema procesu somatske embriogeneze. TSA (0.1–5 μM primenjen u trajanju od 1, 7 ili 14 dana) nije mogao da zameni ni NAA ni GA3 u indukciji somatske embriogeneze, ali je u kombinaciji sa 10 μM NAA+5 μM GA3 ili 20 μM NAA+5 μM GA3 uticao na značajno povećanje embriogenog potencijala eksplantata. Pozitivan uticaj TSA na indukciju somatske embriogeneze je pre svega zavisio od dužine trajanja tretmana. Duži TSA treatman je bio potreban u kombinaciji sa nižom koncentracijom NAA i obrnuto. Uočen je i značajan uticaj dimetil sulfoksida, koji je korišćen kao rastvarač TSA, na povećanje embriogenog potencijala eksplantata. Kvalitet svetlosti je takođe značajno uticao na embriogeni potencijal eksplantata. Najveći embriogeni potencijal su imali eksplantati kultivisani pod plavom LED svetlošću. Eksplantati kultivisani pod belom LED i fluorescentnom svetlošću su imali značajno niži embriogeni potencijal, dok je regeneracija somatskih embriona bila potpuno inhibirana u eksplantatima kultivisanim pod crvenom LED svetlošću ili u mraku. Da bi se rasvetlio mehanizam delovanja GA i svetlosti na indukciju procesa somatske embriogeneze, sprovedena je detaljna analiza metabolizma GA u eksplantatima tokom indukcije somatske embriogeneze analizom ekspresije gena koji kodiraju ključne enzime za biosintezu (SoGA20-ox1 i SoGA3-ox1) i inaktivaciju (SoGA2-ox1, SoGA2-ox2 i SoGA2-ox3) GA, kao i sadržaja endogenih GA. Najveće razlike između embriogenih eksplantata (kultivisanih na medijumu sa NAA+GA3), i neembriogenih eksplantata (kultivisanih na medijumu bez biljnih regulatora rastenja i razvića ili na medijumu sa GA3 ili NAA) su detektovane u ekspresiji SoGA20-ox1 i SoGA2-ox2 gena. U neembriogenim eksplantatima, ekspresija SoGA20-ox1 je bila niža u odnosu na kontrolu (korenove intaktnih klijanaca) tokom 1 do 14 dana, dok je u embriogenim eksplantatima ekspresija ovog gena tokom celokupnog perioda indukcije SE bila značajno niža u odnosu na kontrolu. Nasuprot tome, ekspresija SoGA2-ox2 je bila značajno veća u embriogenim nego u neembriogenim eksplantatima. Profil ekspresije gena koji kodiraju ključne enzime za metabolizam GA je bio sličan u eksplantatima kultivisanim na medijumu sa NAA+PAC, NAA+GA3 i NAA+GA3+PAC. Slično tome, nisu uočene značajne razlike u ekspresiji navedenih gena u eksplantatima kultivisanim pod fluorescentnom, plavom ili belom LED svetlošću. Navedeno ukazuje da PAC i kvalitet svetlosti stimulišu somatsku embriogenezu kod spanaća nekim drugim mehanizmom koji ne podrazumeva promene na nivou ekspresije gena uključenih u metabolizam GA. U neembriogenim eksplantatima, kultivisanim na medijumu sa 20 μM NAA, detektovan je samo kratkotrajan skok endogene GA3, bez značajnog povećanja koncentracije ostalih bioaktivnih GA. Nasuprot tome, u embriogenim eksplantatima, kultivisanim na medijumu sa 20 μM NAA+5 μM GA3, je detektovan značajno veći i dugotrajniji skok GA3, koji se reflektovao uticajem na značajno povećanje nivoa većine endogenih bioaktivnih GA (GA1, GA4 i GA7). Rezultati ukazuju da je drastično povećanje koncentracije bioaktivnih GA u eksplantatima u korelaciji sa indukcijom somatske embriogeneze kod spanaća.