Identifikacija AGP gena kičice (Centaurium erythraea, Gentianaceae) i praćenje njihove ekspresije u odgovoru na mehaničke povrede biljnog tkiva gajenog in vitro
Identification of AGP genes in centaury (Centaurium erythraea, Gentianaceae) and monitoring of their expression in response to tissue mechanical wounding in vitro
Апстракт:
Arabinogalaktanski proteini (AGP) su ekstenzivno glikozilovani proteini ćelijskog zida i predstavljaju podklasu O-glikozilovanih glikoproteina bogatih hidroksiprolinom (HRGP). Odlikuje ih visoka raznolikost primarne strukture, velika familija gena koja ih kodira, kao i širok spektar uloga tokom rastenja i razvića biljaka. AGP su proteini sa neuređenom strukturom što otežava njihovu identifikaciju na osnovu homologije sekvenci. Sa ciljem poboljšanja metodologije za identifikaciju i analizu HRGP sekvenci u sklopu ove doktorske disertacije razvijen je pristup zasnovan na mašinskom učenju. Ovaj pristup koristi glavnu odliku HRGP, a to je prisustvo nekarakteristične aminokiseline hidroksiprolina. Model za predviđanje verovatnoće hidroksilacije prolina na osnovu lokalne sekvence proteina inkorporiran je u ragp R paket uz brojne druge alate koji omogućavaju analize proteinskih sekvenci kao što su: klasifikacija HRGP sekvenci, fleksibilna pretraga karakterističnih motiva, efikasna komunikacija sa serverima za predviđanje N-terminalne signalne sekvence, mesta dodavanja glikozil-fosfatidilinozitolnog sidra, određivanje položaja neuređenih regiona i anotaciju domena u sekvencama. Navedena metodologija omogućava prilagodljivu identifikaciju sekvenci pri kojoj izbor nekoliko parametara utiče na rigoroznost procesa, a time i broj identifikovanih sekvenci. Navedeni softver omogućava efikasnu identifikaciju HRGP sekvenci u celim biljnim proteomima što predstavlja preduslov za njihovo dalje ispitivanje. Kičicu (Centaurium erythraea) karakteriše velika razvojna plastičnost i snažan morfogenetski potencijal, što je čini pogodnim model organizmom za istraživanja u razvojnoj biologiji. AGP su identifikovani kao značajan biohemijski marker somatske embriogeneze i organogeneze kičice i kao takvi mogu biti značajni za proces regeneracije kako biljaka gajenih u uslovima in vitro, tako i onih u prirodi. Povrede predstavljaju sastavni deo manipulacije biljnim tkivom in vitro i mogu indukovati morfogenetske procese. Odgovor biljke indukovan Yariv reagensom, koji specifično precipituje AGP, najsličniji je odgovoru indukovanom mehaničkim povredama biljnog tkiva. Može se pretpostaviti da postoji veza između procesa koji se odigravaju u i na ćeliji, a koji su inicirani mehaničkim povredama ili primenom Yariv reagensa kao i tokom indukcije somatske embriogeneze i organogeneze kičice. Nedavno sekvenciran transkriptom kičice uz razvoj ragp R paketa omogućio je identifikaciju velikog broja HRGP i AGP sekvenci kičice. Od identifikovanih sekvenci odabrano je osamnaest predstavnika za ispitivanje ekspresije u različitim uslovima. Ekspresija odabranih gena praćena je: a) 48 h nakon mehaničke povrede lista i korena biljaka kičice gajenih u uslovima in vitro b) u eksplantatima lista i korena kičice gajenih na različitim koncentracijama Yariv reagensa c) u različitim uzorcima biljaka gajenih in vitro, biljaka iz prirode i iz različitih morfogenetskih procesa kičice (somatske embriogeneze i organogeneze). Od odabranih osamnaest gena, CeAGp6, koji kodira kratak AG peptid, bio je izraženo indukovan nakon mehaničke povrede lista, a reprimiran nakon povrede korena. Moguće je da ovaj AG peptid uključen u određen tip prenosa signala nakon povrede biljnog tkiva. Pored njega CeFLA1, koji je pokazao povećanje ekspresije tokom 48 h nakon povrede lista, a indukovan je i u embriogenom kalusu, mogao bi biti deo mreže koja povezuje povrede i somatsku embriogenezu.