Izučavanje ekspresije gena - kako dobiti tačne i pouzdane podatke kvantitativnim RT PCR-om u realnom vremenu

Abstract

Real-time RT PCR has been recognized as an accurate, reliable and sensitive method for quantifying gene transcription. However, several steps preceding PCR represent critical points and source of inaccuracies. These steps include cell processing, RNA extraction, RNA storage, assessment of RNA concentration and cDNA synthesis. To compensate for potential variability introduced by the procedure, normalization of target gene expression has been established. Accurate normalization has become an absolute prerequisite for the correct quantification of gene expression. Several strategies are in use for the normalization of data, including normalization to sample size, to total RNA or to an internal reference. Among these, the use of housekeeping genes as an internal (endogenous) control is the most common approach. Given the increased sensitivity, reproducibility and large dynamic range of this methodology, the requirements for a proper reference gene for normalization have become increasingly stringent. The aim of this paper is to discuss the concept of normalization in mRNA quantification, as well as to discuss several statistical algorithms developed to help the validation of potential reference genes. By showing that the use of inappropriate endogenous control might lead to incorrect results and misinterpretation of experimental data, we are joining the creators of Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments (MIQE) in an attempt to convince scientists that proper validation of potential reference genes is an absolute prerequisite for correct normalization and, therefore, for providing accurate and reliable data by quantitative real-time RT PCR gene expression analyses.

RT-PCR je prepoznat kao precizna, pouzdana i osetljiva metoda za kvantifikaciju transkripcije gena. Međutim, ovoj metodi prethodi nekoliko koraka koji predstavljaju kritične tačke i izvor potencijalnih grešaka. Ovi koraci uključuju obradu ćelijskog materijala, ekstrakciju i čuvanje RNK, određivanje koncentracije RNK i sintezu cDNK. Da bi se kompenzovala potencijalna varijabilnost nastala tokom procedure, uvedena je normalizacija ekspresije ciljnih gena. Precizna normalizacija je postala apsolutni preduslov za tačnu kvantifikaciju ekspresije gena. Postoji nekoliko strategija za normalizaciju eksperimentalnih podataka, uključujući normalizaciju u odnosu na veličinu uzorka, ukupnu RNK ili internu kontrolu (referencu). Kao interna (endogena) kontrola najčešće se koriste geni sa stabilnom ekspresijom. Imajući u vidu veliku osetljivost, reproducibilnost i veliki dinamički opseg PCR metode, zahtevi za odgovarajućim referentnim genima koji će se koristiti za normalizaciju podataka postali su veoma restriktivni. Cilj ovog rada je da razjasni koncept normalizacije i prokomentariše nekoliko statističkih algoritama koji su razvijeni kako bi pomogli u validaciji potencijalnih referentnih gena. Pokazujući da korišćenje neodgovarajućih referentnih gena (endogenih kontrola) može da dovede do netačnih rezultata i pogrešne interpretacije eksperimentalnih podataka, mi se priključujemo tvorcima uputstva MIQE (eng. Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) u pokušaju da ubedimo naučnu javnost da je ispravna validacija potencijalnih referentnih gena apsolutni preduslov za tačnu normalizaciju i, shodno tome, preduslov za dobijanje tačnih i pouzdanih podataka u analizi ekspresije gena metodom kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu.