Изолација и функционална карактеризација гена за бета- глукозидазу врсте Centaurium erythraea Rafn

Abstract

Кичица (Centaurium erythraea Rafn) представља богат извор фармаколошки активних специјализованих метаболита, од којих су најзаступљенији секоиридоиди. Биосинтеза и разградња секоиридоида код кичице су координисани процеси који обезбеђују конститутивно присуство ових материја у ткивима биљке. Скелет молекула секоиридоидних глукозида се заснива на циклопентан-C-пирану за који је, на позицији C1, везан молекул β-D глукозе. У реакцији секоиридоидних глукозида са хидролитичким ензимима ослобађају се одговарајући агликони који се даље могу укључити у метаболичке процесе биљке. Код кичице су уочене две варијанте ензима бета-глукозидаза које припадају ензимској породици глукозидних хидролаза 1 (GH1). Гени за ензиме CeBGLU1 и CeBGLU2 су хетеролого експримирани у организму домаћину (Escherichia coli), а након изолације и пречишћавања рекомбинантних протеина, урађени су in vitro ензиматски тестови за потврду фунције ензима. Обе изоформе ензима показују високу специфичност за секоиридоидне глукозиде као супстрат чиме је по први пут потврђена функција биљних бета-глукозидаза карактеристичних за ову групу једињења. Привремена експресија CeBGLU1 и CeBGLU2 у листовима кичице, техником агроинфилтрације, довела је до редукције садржаја секоиридоида у листoвима, у случајевима када су CeBGLU1 и CeBGLU2 ко-експримирани заједно са p19 супресором. На тај начин је додатно потврђена функција два ензима, за које је утврђено да каталишу почетни корак у катаболизму секоиридоидних глукоида код кичице.

Kičica (Centaurium erythraea Rafn) predstavlja bogat izvor farmakološki aktivnih specijalizovanih metabolita, od kojih su najzastupljeniji sekoiridoidi. Biosinteza i razgradnja sekoiridoida kod kičice su koordinisani procesi koji obezbeđuju konstitutivno prisustvo ovih materija u tkivima biljke. Skelet molekula sekoiridoidnih glukozida se zasniva na ciklopentan-C-piranu za koji je, na poziciji C1, vezan molekul β-D glukoze. U reakciji sekoiridoidnih glukozida sa hidrolitičkim enzimima oslobađaju se odgovarajući aglikoni koji se dalje mogu uključiti u metaboličke procese biljke. Kod kičice su uočene dve varijante enzima beta-glukozidaza koje pripadaju enzimskoj porodici glukozidnih hidrolaza 1 (GH1). Geni za enzime CeBGLU1 i CeBGLU2 su heterologo eksprimirani u organizmu domaćinu (Escherichia coli), a nakon izolacije i prečišćavanja rekombinantnih proteina, urađeni su in vitro enzimatski testovi za potvrdu funcije enzima. Obe izoforme enzima pokazuju visoku specifičnost za sekoiridoidne glukozide kao supstrat čime je po prvi put potvrđena funkcija biljnih beta-glukozidaza karakterističnih za ovu grupu jedinjenja. Privremena ekspresija CeBGLU1 i CeBGLU2 u listovima kičice, tehnikom agroinfiltracije, dovela je do redukcije sadržaja sekoiridoida u listovima, u slučajevima kada su CeBGLU1 i CeBGLU2 ko-eksprimirani zajedno sa p19 supresorom. Na taj način je dodatno potvrđena funkcija dva enzima, za koje je utvrđeno da katališu početni korak u katabolizmu sekoiridoidnih glukoida kod kičice.