Genetička transformacija kičice (Centaurium erythraea Rafn.) AtCKX1 i AtCKX2 genima
Genetic transformation of Centaury (Centaurium erythraea Rafn.) using AtCKX1 and AtCKX2 genes
2012
Аутори:
Trifunović-Momčilov, MilanaОстала ауторства
Dragićević, IvanaSubotić, Angelina
Simonović, Ana
Тип документа:
Докторска теза (Објављена верзија)
Метаподаци
Приказ свих података о документуАпстракт:
Biljna vrsta Centaurium erythraea Rafn., u našem narodu poznata kao kičica, od davnina se
upotrebljava kao lek za sniženje temperature i nivoa šećera u krvi, lečenje anemije, žutice i
gihta, za jačanje apetita i povećanje stomačne sekrecije. Zbog poznatih lekovitih svojstava,
kičica se nalazi u mnogim farmakopejama. Kao početni materijal za uspostavljanje kulture
korenova in vitro korišćeni su vrhovi adventivnih korenova prosečne dužine ~10 mm koji
su izolovani od sterilno dobijenih klijanaca kičice i dalje su gajeni na čvrstoj MS hranljivoj
podlozi bez regulatora rastenja. Proces organogeneze u kulturi korenova kičice je spontan.
Posle sedam dana gajenja u kulturi na bazalnom delu početnog eksplantata uočavaju se
prve promene. Koren zadebljava i tkivo počinje da puca celom dužinom bazalnog dela.
Tokom četvoronedeljnog pasaža, duž razraslog dela eksplantata, formira se veliki broj
adventivnih pupoljaka. U cilju dobijanja transgenih biljaka sa sniženim nivoom endogenih
citokinina, za transformaciju su korišćena dva bakterijska soja Agrobacterium tumefaciens
GV3101 koji nose pBinHTX plazmid sa dva različita gena, AtCKX1 odnosno AtCKX2, koji
kodiraju enzim citokinin oksidazu/dehidrogenazu (CKX). Efikasna integracija AtCKX1
gena (30% ) i AtCKX2 gena (28.2% ) određena je PCR analizom genomske DNK. U cilju
što boljeg određivanja nivoa ekspresije AtCKX gena kičice prvo je bilo neophodno urađena
je optimizacija PCR protokola sa prajmerima za qPCR. Ovaj postupak sastojao se u
pronalaženju optimalne temperature vezivanja prajmera uz istovremenu primenu različitih
aditiva odnosno pojačivača PCR reakcije. Dodavanje 5% DMSO-a u qPCR reakcije
značajno je poboljšalo specifičnost amplifikacije AtCKX1 i AtCKX2 gena kičice. qRT-PCR
analizom potvrđena je ekspresija AtCKX1 i AtCKX2 gena kod 50% odnosno 64%
analiziranih linija. U ovom radu uspešno je pokazano da ekspresija AtCKX gena u
transgenim biljkama kičice značajno utiče na metabolizam citokinina. Ključni faktor u
kontroli nivoa citokinina u biljnim tkivima predstavlja CKX enzim, jedini do sada poznati
enzim koji učestvuje u katabolizmu citokinina. Specifična aktivnost CKX enzima
određivana je u izdancima i korenovima svih transgenih AtCKX linija. Analiza količine i
sadržaja ukupnih kao i pojedinačnih grupa endogenih citokinina netransfromisanih biljaka
kičice omogućila je, po prvi put, određivanje citokiniskog profila kičice in vitro. Takođe je
pokazano da se promene u metabolizmu citokinina prilično nepredvidivo odražavaju na
količinu auksina tj. količinu ukupne endogene IAA u samom biljnom tkivu. Uspešno je
pokazano da ekpresija AtCKX gena takođe utiče i na neke morfološke parametre
transformisanih biljaka kičice. Promenjena citokininska homeostaza utiče na smanjenje
morfogenetskog potencijala transformisanih biljaka kičice, ali ne utiče na značajno
odstupanje prirasta mase izdanaka u odnosu na kontrolu. Rezultati analize fotosintetičkih
pigmenata kičice ukazuju na to da sniženje citokinina može biti jedan od preduslova, ali ne
i sam signal za početak senescencije. Dominantne farmakološki aktivne supstance kičice su
sekoiridoidi i ksantoni. Sadržaj sekoiridoidnih komponenti biljaka in vitro ne razlikuje se
mnogo u odnosu na biljke iz prirode dok se količina ksantonskih jedinjenja značajno
povećava kod biljaka gajenih in vitro. Većina transgenih AtCKX linija kičice produkuje
manje sekoiridoida u odnosu na biljke in vitro i biljke iz prirode. Povećana akumulacija
ksantona određena je u skoro svim AtCKX linijama kičice u poređenju sa biljkama iz
prirode. Imajući u vidu da su ksantoni sve više u upotrebi zbog svojih farmakoloških
svojstava, transgene AtCKX linije kičice mogle bi biti koristan izvor biljnog materijala u
proizvodnji novih lekova.
Кључне речи:
Centaurium erythraea Rafn.; Agrobacterium tumefaciens; Genetička transformacija; qRT-PCR; AtCKX geni; CKX aktivnost; Citokinini; Sekundarni metaboliti; Sekoiridoidi; KsantoniИзвор:
University of Belgrade, Faculty of Biology, 2012, 1-177URI
http://eteze.bg.ac.rs/application/showtheses?thesesId=14https://fedorabg.bg.ac.rs/fedora/get/o:2091/bdef:Content/download
http://vbs.rs/scripts/cobiss?command=DISPLAY&base=70036&RID=
http://nardus.mpn.gov.rs/123456789/2021
https://radar.ibiss.bg.ac.rs/handle/123456789/2425
Колекције
Институција/група
IBISSAPA:
Trifunović, M. (2012). Genetička transformacija kičice (Centaurium erythraea Rafn.) AtCKX1 i AtCKX2 genima. University of Belgrade, Faculty of Biology. p. 177.Vancouver:
Trifunović M. Genetička transformacija kičice (Centaurium erythraea Rafn.) AtCKX1 i AtCKX2 genima [#dissertation]. Belgrade: University of Belgrade, Faculty of Biology; 2012. 177 p.Related items
Showing items related by title, author, creator and subject.
-
Fiziološki i morfološki efekti ekspresije AtCKX gena u transformisanim biljkama krompira (Solanum tuberosum L.) gajenim in vitro / Physiological and morphological effects of expression of AtcKX genes in transformed potato (Solanum tuberosum l.) plants grown in vitro
Raspor, Martin (Belgrade: University of Belgrade, Faculty of Biology, 2013) -
Overexpression of Arabidopsis cytokinin oxidase/dehydrogenase genes AtCKX1 and AtCKX2 in transgenic Centaurium erythraea Rafn.
Trifunović-Momčilov, Milana; Cingel, Aleksandar; Simonović, Ana; Jevremović, Slađana; Petrić, Marija P; Dragicević, Ivana C; Motyka, Vaclav; Dobrev, Petre I; Zahajska, Lenka; Subotić, Angelina (Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2013) -
Genetic Transformation of Centaurium erythraea with AtCKX1 and AtCKX2 Genes Using Agrobacterium tumefaciens
Trifunović-Momčilov, Milana; Cingel, Aleksandar; Milošević, Snežana; Subotić, Angelina; Jevremović, Slađana; Petrić, Marija P; Dragicević, Ivana C (In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, 2010)