Izučavanje ekspresije gena - kako dobiti tačne i pouzdane podatke kvantitativnim RT PCR-om u realnom vremenu
Gene expression studies: How to obtain accurate and reliable data by quantitative real-time RT PCR
Апстракт:
RT-PCR je prepoznat kao precizna, pouzdana i osetljiva metoda za kvantifikaciju transkripcije gena. Međutim, ovoj metodi prethodi nekoliko koraka koji predstavljaju kritične tačke i izvor potencijalnih grešaka. Ovi koraci uključuju obradu ćelijskog materijala, ekstrakciju i čuvanje RNK, određivanje koncentracije RNK i sintezu cDNK. Da bi se kompenzovala potencijalna varijabilnost nastala tokom procedure, uvedena je normalizacija ekspresije ciljnih gena. Precizna normalizacija je postala apsolutni preduslov za tačnu kvantifikaciju ekspresije gena. Postoji nekoliko strategija za normalizaciju eksperimentalnih podataka, uključujući normalizaciju u odnosu na veličinu uzorka, ukupnu RNK ili internu kontrolu (referencu). Kao interna (endogena) kontrola najčešće se koriste geni sa stabilnom ekspresijom. Imajući u vidu veliku osetljivost, reproducibilnost i veliki dinamički opseg PCR metode, zahtevi za odgovarajućim referentnim genima koji će se koristiti za normalizaciju podataka postali su veoma restriktivni. Cilj ovog rada je da razjasni koncept normalizacije i prokomentariše nekoliko statističkih algoritama koji su razvijeni kako bi pomogli u validaciji potencijalnih referentnih gena. Pokazujući da korišćenje neodgovarajućih referentnih gena (endogenih kontrola) može da dovede do netačnih rezultata i pogrešne interpretacije eksperimentalnih podataka, mi se priključujemo tvorcima uputstva MIQE (eng. Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) u pokušaju da ubedimo naučnu javnost da je ispravna validacija potencijalnih referentnih gena apsolutni preduslov za tačnu normalizaciju i, shodno tome, preduslov za dobijanje tačnih i pouzdanih podataka u analizi ekspresije gena metodom kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu.