Uticaj restriktivnog režima ishrane na plastičnost neurona i glije nakon povrede senzomotorne kore mozga pacova

Abstract

Traumatska povreda mozga (engl. traumatic brain injury, TBI) predstavlja povredu moždanog tkiva uzrokovanu mehaničkom povredom glave. TBI je jedan od vodećih uzroka smrtnosti i invaliditeta u svetu, u populaciji ljudi do 45 godina starosti. Posledice TBI zavise od lokalizacije i količine oštećenja moždanog tkiva i mogu varirati od blažih motoričkih i kognitivnih smetnji, pa sve do težih oblika invaliditeta i smrti. Traumatska povreda mozga dovodi do narušavanja krvno-moždane barijere, što rezultuje tačno određenim sledom događaja u povređenom tkivu CNS-a. Naime, akutna faza, označena kao primarna povreda, nastaje direktnim delovanjem mehaničke sile na moždano tkivo i javlja se u trenutku povrede. Događaji koji slede nakon toga označeni su kao sekundarna povreda koja nastaje kao posledica inicijalnog oštećenja, a obuhvata procese koji dovode do daljeg oštećenja tkiva u danima i nedeljama nakon povrede. To su pre svega zapaljenski procesi koji dovode do smrti neurona koji prvobitno nisu bili zahvaćeni mehaničkom povredom. Smatra se da je broj neurona koji umre usled širenja sekundarne povrede daleko veći od broja neurona koji strada usled primarne povrede. Činjenica da se većina procesa u okviru sekundarne povrede odigrava relativno kasno (satima i danima nakon povrede) čini ih podložnim različitim terapeutskim intervencijama. Već decenijama je poznato da restrikcija hrane povoljno deluje na čitav organizam tako što odlaže starosno-zavisne fiziološke promene i smanjuje incidencu različitih obolenja (kancer, autoimunske bolesti, Parkinsonova i Alchajmerova bolest, itd.) Međutim, tek u poslednjih desetak godina intenzivno se istražuje uticaj smanjenog unosa hrane na procese oporavka nakon povrede. Dosadašnja istraživanja na ovom polju su pokazala da restrikcija hrane u trajanju od nekoliko meseci pre povrede CNS-a ima neuroprotektivno dejstvo i promoviše funkcionalni oporavak u nekoliko različitih modela povrede. Efekti dijetalne restrikcije na različite aspekte sekundarne povrede, kao i na sekundarnu ćelijsku smrt nakon traumatske povrede mozga još uvek nisu dovoljno ispitani. Stoga je cilj ovog istraživanja bio je da se utvrdi da li i u kojoj meri dijetalna restrikcija (DR) može uticati na procese koji se u mozgu dešavaju nakon povrede, a pre svega, da li može da utiče na procese sekundarne povrede. Za potrebe eksperimenta, mužjaci pacova Wistar soja stari 3 meseca su podeljeni u dve grupe, ad libitum životinje (AL) i životinje na restriktivnom režimu ishrane (DR). Životinje iz AL grupe imale su neograničen pristup hrani tokom čitavog vremena trajanja eksperimenta, dok su životinje iz DR grupe dobijale 50% normalnog dnevnog unosa hrane. Sa navršenom starošću od 6 meseci životinje su podvrgnute ubodnoj leziji senzomotorne kore prednjeg mozga, a zatim su žrtvovane u različitim vremenskim tačkama: kontrola, 2, 7, 14. i 28. dan nakon lezije. Kako bi se utvrdio efekat dijetalne restrikcije na oporavak nakon traumatske povrede mozga praćeni su procesi inflamacije, sekundarne neurodegeneracije i neuralne plastičnosti. Primenom metoda Western blot analize, RT- i PCR-a u realnom vremenu, histološkog bojenja i imunohistohemije ispitivane su promene u vremenskoj i prostornoj ekspresiji ciljnih iRNK i proteina, markera ovih procesa. Rezultati dobijeni u okviru ove disertacije pokazuju da dijetalna restrikcija u značajnoj meri menja odgovor tkiva mozga na povredu, utičući na brojne procese nakon povrede. Naime, dobijeni rezultati su pokazali da dijetalna restrikcija utiče na procese inflamacije suprimirajući aktivaciju mikroglijskih ćelija, kao i indukciju solubilnog TNF-α proteina nakon povrede. Takođe, DR deluje neuroprotektivno suprimirajući indukciju aktivne kaspaze-3 i sekundarnu smrt neurona u ranoj fazi oporavka nakon povrede mozga. Dijetalna restrikcija povećava ekspresiju proteina sinaptičke plastičnosti GAP-43 i sinaptofizina oko samog mesta povrede, uz istovremenu supresiju aktivacije astrocita i smanjenje sinteze inhibitornog proteoglikana neurokana. Takođe, DR dovodi do izrazitog povećanja koncentracije kortikosterona, kao i posledične promene u fosforilaciji GR-a, i u nivou 11β-HSD1 proteina nakon povrede. Dijetalna restrikcija je uticala i na ekspresiju transkripcionog faktora NF-κB, kao i na ekspresiju iRNK za Bcl-2 i Bcl-xL, antiapoptotskih gena koje reguliše NF-κB. Rezultati ove studije su pokazali da dijetalna restrikcija ima kapacitet da u značajnoj meri oblikuje odgovor povređenog tkiva mozga direktnim uticajem na procese sekundarne povrede, ali i plastičnosti. Takođe, ovi rezultati ukazuju na mogućnost primene dijetalne restrikcije i u kliničkoj praksi kod povreda mozga.

Traumatska povreda mozga (engl. traumatic brain injury, TBI) predstavlja povredu moždanog tkiva uzrokovanu mehaničkom povredom glave. TBI je jedan od vodećih uzroka smrtnosti i invaliditeta u svetu, u populaciji ljudi do 45 godina starosti. Posledice TBI zavise od lokalizacije i količine oštećenja moždanog tkiva i mogu varirati od blažih motoričkih i kognitivnih smetnji, pa sve do težih oblika invaliditeta i smrti. Traumatska povreda mozga dovodi do narušavanja krvno-moždane barijere, što rezultuje tačno određenim sledom događaja u povređenom tkivu CNS-a. Naime, akutna faza, označena kao primarna povreda, nastaje direktnim delovanjem mehaničke sile na moždano tkivo i javlja se u trenutku povrede. Događaji koji slede nakon toga označeni su kao sekundarna povreda koja nastaje kao posledica inicijalnog oštećenja, a obuhvata procese koji dovode do daljeg oštećenja tkiva u danima i nedeljama nakon povrede. To su pre svega zapaljenski procesi koji dovode do smrti neurona koji prvobitno nisu bili zahvaćeni mehaničkom povredom. Smatra se da je broj neurona koji umre usled širenja sekundarne povrede daleko veći od broja neurona koji strada usled primarne povrede. Činjenica da se većina procesa u okviru sekundarne povrede odigrava relativno kasno (satima i danima nakon povrede) čini ih podložnim različitim terapeutskim intervencijama. Već decenijama je poznato da restrikcija hrane povoljno deluje na čitav organizam tako što odlaže starosno-zavisne fiziološke promene i smanjuje incidencu različitih obolenja (kancer, autoimunske bolesti, Parkinsonova i Alchajmerova bolest, itd.) Međutim, tek u poslednjih desetak godina intenzivno se istražuje uticaj smanjenog unosa hrane na procese oporavka nakon povrede. Dosadašnja istraživanja na ovom polju su pokazala da restrikcija hrane u trajanju od nekoliko meseci pre povrede CNS-a ima neuroprotektivno dejstvo i promoviše funkcionalni oporavak u nekoliko različitih modela povrede. Efekti dijetalne restrikcije na različite aspekte sekundarne povrede, kao i na sekundarnu ćelijsku smrt nakon traumatske povrede mozga još uvek nisu dovoljno ispitani. Stoga je cilj ovog istraživanja bio je da se utvrdi da li i u kojoj meri dijetalna restrikcija (DR) može uticati na procese koji se u mozgu dešavaju nakon povrede, a pre svega, da li može da utiče na procese sekundarne povrede. Za potrebe eksperimenta, mužjaci pacova Wistar soja stari 3 meseca su podeljeni u dve grupe, ad libitum životinje (AL) i životinje na restriktivnom režimu ishrane (DR). Životinje iz AL grupe imale su neograničen pristup hrani tokom čitavog vremena trajanja eksperimenta, dok su životinje iz DR grupe dobijale 50% normalnog dnevnog unosa hrane. Sa navršenom starošću od 6 meseci životinje su podvrgnute ubodnoj leziji senzomotorne kore prednjeg mozga, a zatim su žrtvovane u različitim vremenskim tačkama: kontrola, 2, 7, 14. i 28. dan nakon lezije. Kako bi se utvrdio efekat dijetalne restrikcije na oporavak nakon traumatske povrede mozga praćeni su procesi inflamacije, sekundarne neurodegeneracije i neuralne plastičnosti. Primenom metoda Western blot analize, RT- i PCR-a u realnom vremenu, histološkog bojenja i imunohistohemije ispitivane su promene u vremenskoj i prostornoj ekspresiji ciljnih iRNK i proteina, markera ovih procesa. Rezultati dobijeni u okviru ove disertacije pokazuju da dijetalna restrikcija u značajnoj meri menja odgovor tkiva mozga na povredu, utičući na brojne procese nakon povrede. Naime, dobijeni rezultati su pokazali da dijetalna restrikcija utiče na procese inflamacije suprimirajući aktivaciju mikroglijskih ćelija, kao i indukciju solubilnog TNF-α proteina nakon povrede. Takođe, DR deluje neuroprotektivno suprimirajući indukciju aktivne kaspaze-3 i sekundarnu smrt neurona u ranoj fazi oporavka nakon povrede mozga. Dijetalna restrikcija povećava ekspresiju proteina sinaptičke plastičnosti GAP-43 i sinaptofizina oko samog mesta povrede, uz istovremenu supresiju aktivacije astrocita i smanjenje sinteze inhibitornog proteoglikana neurokana. Takođe, DR dovodi do izrazitog povećanja koncentracije kortikosterona, kao i posledične promene u fosforilaciji GR-a, i u nivou 11β-HSD1 proteina nakon povrede. Dijetalna restrikcija je uticala i na ekspresiju transkripcionog faktora NF-κB, kao i na ekspresiju iRNK za Bcl-2 i Bcl-xL, antiapoptotskih gena koje reguliše NF-κB. Rezultati ove studije su pokazali da dijetalna restrikcija ima kapacitet da u značajnoj meri oblikuje odgovor povređenog tkiva mozga direktnim uticajem na procese sekundarne povrede, ali i plastičnosti. Takođe, ovi rezultati ukazuju na mogućnost primene dijetalne restrikcije i u kliničkoj praksi kod povreda mozga.