Genetička transformacija lista i korena kičice (Centaurium erythraea) GV3101 sojem A. tumefaciens

Abstract

Описана је метода за транформацију C. erythraea сојем GV3101 А. tumefaciens, тестирана на одсечцима листова и врховима коренова биљака гајених in vitro. Сој GV3101 носи бинарни плазмид pXK7S2D који обезбеђује резистенцију на канамицин. Након кокултивације експлантати су преношени на серију подлога за регенерацију са додатком различитих регулатора растења: 1 mg·l-1 бензиламинопурина, 0.1 или 0.4 mg·l-1 индол-3-сирћетне киселине и 1 mg·l-1 кинетина. Као селекциони антибиотик коришћен је канамицин у концентрацији од 50 mg·l-1 за листове или 25 mg·l-1 за коренове, док су цефотаксим и ванкомицин концентрација 250 mg·l-1, односно 50 mg·l-1 додавани у подлогу ради превенције раста бактерија. Контролни експлантати су преношени на подлоге истог састава и на подлогу без канамицина. Након 6 недеља на листовима су уочени спонтано формирани изданци, док на кореновима није запажена регенерација, чак ни на контролним експлантатима. Изданци формирани на листовима одсецани су, пребацивани на MS подлогу са 0.2 mg·l-1 индол-3-бутерне киселине и 150 mg·l-1 цефотаксима и гајени до потпуног формирања биљке. Регенерисане биљке су тестиране на присуство трансгена методом Phire PCR-a. Успешност трансформације износила је 17.64%. Имајући у виду да је до сада помоћу A. tumefaciens трансформисано само неколико биљних врста из фамилије Gentianaceae, описана техника за трансформацију листа нуди перспективу за даљу примену, нарочито на врстама рода Centaurium.

Opisana je metoda za tranformaciju C. erythraea sojem GV3101 A. tumefaciens, testirana na odsečcima listova i vrhovima korenova biljaka gajenih in vitro. Soj GV3101 nosi binarni plazmid pXK7S2D koji obezbeđuje rezistenciju na kanamicin. Nakon kokultivacije eksplantati su prenošeni na seriju podloga za regeneraciju sa dodatkom različitih regulatora rastenja: 1 mg·l-1 benzilaminopurina, 0.1 ili 0.4 mg·l-1 indol-3-sirćetne kiseline i 1 mg·l-1 kinetina. Kao selekcioni antibiotik korišćen je kanamicin u koncentraciji od 50 mg·l-1 za listove ili 25 mg·l-1 za korenove, dok su cefotaksim i vankomicin koncentracija 250 mg·l-1, odnosno 50 mg·l-1 dodavani u podlogu radi prevencije rasta bakterija. Kontrolni eksplantati su prenošeni na podloge istog sastava i na podlogu bez kanamicina. Nakon 6 nedelja na listovima su uočeni spontano formirani izdanci, dok na korenovima nije zapažena regeneracija, čak ni na kontrolnim eksplantatima. Izdanci formirani na listovima odsecani su, prebacivani na MS podlogu sa 0.2 mg·l-1 indol-3-buterne kiseline i 150 mg·l-1 cefotaksima i gajeni do potpunog formiranja biljke. Regenerisane biljke su testirane na prisustvo transgena metodom Phire PCR-a. Uspešnost transformacije iznosila je 17.64%. Imajući u vidu da je do sada pomoću A. tumefaciens transformisano samo nekoliko biljnih vrsta iz familije Gentianaceae, opisana tehnika za transformaciju lista nudi perspektivu za dalju primenu, naročito na vrstama roda Centaurium.